L-精氨酸与纤维连接蛋白联合应用对创面愈合的影响

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[摘要]目的：观察l-精氨酸（L-arginine，L-Arg）与纤维连接蛋白（fibronectin，FN）联合应用对伤口愈合过程的影响。 方法：建立大鼠背部创伤模型，在创面局部应用纤维连结蛋白同时应用L-精氨酸灌胃，分别在术后3、7、10、14天切取创面的愈合组织，进行HE、VG染色和免疫组织化学染色。实验结果用SPSS12.0 for windows统计软件，采用单因素方差分析方法进行统计学处理。结果：与对照组相比，联合应用FN和L-Arg组实验动物创面的愈合时间明显比对照组和两种药物单独应用组缩短，差异有显著性（P＜0.05）。结论：L-Arg和FN联合应用对促进大鼠背部创面的修复，缩短伤口的愈合时间具有显著的效果。

[关键词]创伤愈合；纤维连结蛋白；L-精氨酸；联合应用；免疫组织化学染色

[中图分类号]R651.1 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1028-04

The influence of L-Arginine mixed with fibronectin on the wound healing

QIU Shu-lin,CHU Guo-hua,ZHANG Pei-pei,ZHAO Wei,ZHU Hao,YAN Yan,HAN Sheng,FENG Min,YAO Jin-ying

(Department of Plastic Surgery, Hebei People'S Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effection of L-Arg mixed with FN on speed and quantity of the wound healing.MethodsBy making the wound model on the back of rats, each wound surface was injected with FN and lavaged with L-Arg. The tissue in the wound surface was taken respectively on the day of 3 days, 7 days, 10 days and 14 days. The sections of hematoxylin-eosin stain, collagen fibrils specific stain (Van Gieson,s) and immunohistochemistry were observed. All groups mean values were tested by SPSS12.0 in statistical management.ResultsCompared with the control group and the one medicine used alone , using FN combined with L-Arg shorten the cure course obviously, and the result is significant（P

Key words: wound healing; fibronectin; L-arginine; combination; immunohistochemistry

已有研究证实，纤维连结蛋白（fibronectin，FN）和L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）对创伤愈合具有程度不同的促进作用，但二者联合应用对创面愈合的影响目前尚未见报道。本实验旨在通过观察联合应用FN和L-Arg对创面愈合的影响，为临床探索一条合理、科学、有效的促进创伤愈合的新途径。

1材料和方法

1.1 实验动物及分组：健康雄性清洁级Wistar大鼠，共48只，平均体重（250±20）g，由河北医科大学实验动物中心提供，随机将动物分为4组，每组12只，即对照组（0.9%生理盐水）、实验A组（联合应用FN+ L-arg）、实验B组（单独应用FN）、实验C组（单独应用L-arg）。

1.2 试剂：L－Arg（Sigma公司），FN（中国医学科学院血液研究所），羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗鼠一氧化氮合酶多克隆抗体（美国NeoMarKers公司），羊抗兔既用型SP法免疫组织化学染色试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.3实验方法：大鼠背部剪毛，10%硫化钠脱毛，温水清洗，拭干。次日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（30mg/kg），成功后，将大鼠固定在手术台上。在背部脊柱两侧旁开1cm，头尾两端平行于脊柱各标记一直径1.8cm，面积2.54cm2的圆形切口线。经碘伏消毒皮肤后，用剪刀沿标记线剪除全层皮肤至深筋膜，形成4个圆形创面。A、B两组每日每个创面筋膜层及创缘皮下组织内注射0.5mg/ml的FN0.05ml（至标本切取前一天止），A组同时将L-Arg按照500mg/kg/天予以灌胃，创面均用生理盐水纱布包扎。实验C组以A组相同方法服用L-Arg，创面用生理盐水纱布包扎。对照组只用生理盐水纱布包扎伤口，各组动物均于手术后给予4万单位庆大霉素肌注，每日一次，连续3天，预防感染。实验动物均单笼饲养，自由进食水。

1.4 标本取材及处理：分别于术后第3、7、10、14天切取以愈合创面中心为圆点直径1.8 cm的圆形组织，4%多聚甲醛固定标本，常规石蜡包埋切片，分别行常规HE染色、VG染色及免疫组化染色。

1.5 观测指标

1.5.1 形态学观察

1.5.2 成纤维细胞数密度测定：400倍光镜下观察标本HE染色切片，在组织中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取10个矩形视野（0.0052mm2/视野），目测计数并计算切片内单位面积成纤维细胞数量，结果取均数。

1.5.3 胶原纤维面密度测定：400倍光镜下观察VG染色组织切片，在组织中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取5个视野，利用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统计算红染的胶原纤维的面密度，结果取均数。

1.5.4 NOS2（iNOS）免疫组化染色：对免疫组化染色切片，光镜观察一氧化氮合酶分布部位，着色深浅程度。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，选取每张切片中阳性细胞最集中区域，随机取互不重叠的5个200倍视野，测阳性目标面积占该视野的面密度，结果取均数。

1.5.5 创面愈合率的测定：采用计算机图像处理仪(德国Zeiss 公司) 进行测量和计算。伤后24 h第一次测量的创面面积为原始创面面积。计算方法：愈合面积=原始创面面积- 各时间点创面面积，创面愈合面积百分比=(愈合面积/创伤面积)×100%。

1.5.6 创面愈合质量的评价：通过测定创面肉芽组织羟脯氨酸含量来反映肉芽组织中胶原合成的情况，评价创面愈合的质量。按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书操作，用比色法测定羟脯氨酸含量。

1.6 统计分析方法：用 SPSS12.0 for windows统计软件，采用单因素方差分析方法进行统计学处理，数据以x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1形态学观察：与对照组比较，实验A组、B组、C组肉芽组织均较对照组肉芽组织生长好，炎症反应轻，愈合时间短，且新生皮肤组织张力较高。实验A组创面愈合质量高于实验B组和C组。

2.2组织学观察

2.2.1 光镜观察：与对照组比较，实验A组、B组、C组新生毛细血管生成较多，成纤维细胞增生活跃。创伤后第7～14天，实验A组较实验B组、C组成纤维细胞数量多，胶原纤维排列较整齐（图1～3）。

2.2.2 成纤维细胞数密度：实验组A、B、C组在创伤后3、7天成纤维细胞数密度均高于对照组水平（P＜0.05），而在创伤后10、14天均低于对照组（P＜0.05）；实验A组较B、C组更为明显（P＜0.01）（见表1）。

2.2.3 胶原面密度：四组均呈持续性增加的趋势，实验组A在所有时间点均高于对照组（P＜0.01）；实验B组、C组在所有时间点亦高于对照组（P＜0.05）（见表2，图4～5）。

2.2.4 NOS2（iNOS）的测定：大鼠皮肤创伤后胶质形成细胞、汗腺、毛囊和骨骼肌细胞以及创伤后肉芽组织的炎症细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞均不同程度的表达NOS2蛋白，免疫组化染色NOS2蛋白呈棕褐色或者棕黄色颗粒分布于上述组织细胞内。与对照组比较，实验A组、B组、C组在伤后第3天细胞阳性染色强度增强，以成纤维细胞、毛细血管内皮细胞为主，呈强阳性染色，新生表皮的阳性染色强度亦增强。3～7天细胞中的NOS2在细胞中的阳性表达相对维持稳定水平，阳性细胞以毛细血管内皮细胞、成纤维细胞为主，均呈强阳性染色，并可见粗大强阳性颗粒密布于创缘角质形成细胞胞浆中，阳性比率较对照组增高（A组P＜0.01，B组、C组P＜0.05），伤后第10天肉芽组织中阳性细胞数增加，细胞中的阳性表达达到高峰，其中A组的峰值明显高于B、C两组，但阳性比率较对照组小（P＜0.05），第14天阳性表达逐渐减弱，阳性比率较对照组高（A组P＜0.01，B、C组P＜0.05），角质形成细胞仍为强阳性表达，但数量逐渐减少，其余细胞阳性染色程度减弱（见图6，表3）。

2.2.5 创面愈合率：A、B、C三组于3天后创面愈合较对照组明显加快，其中A组较B、C组显著加快（A组P＜0.01，B、C组P＜0.05）。A组创面愈合良好，愈合时间较对照组提前3～4天，实验B组、 C组愈合情况良好，较对照组提前1～2天（见表4）。

2.2.6 羟脯氨酸含量：对照组羟脯氨酸含量从创伤后第3天到第14天进行性增加；实验A组在创伤后各时间点羟脯氨酸含量均高于对照组（P＜0.01）；实验B组和C组在各时间点的的羟脯氨酸含量亦高于对照组（P＜0.05）（见表5）。

3讨论

FN广泛存在于机体组织中，具有参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连、维持细胞正常形态、伤后作为基质再生支架、调节细胞运动并促进细胞迁移、参与止血和凝血以及调理、促进细胞分化等生理作用。Arg可逆转许多血管危险因子引起的内皮细胞功能紊乱，改善生殖、呼吸、肾功能、胃肠道、肝功能及免疫功能，有利于创面愈合[2]。药理研究发现L -Arg的促愈合作用主要是通过NO来完成的。

本研究发现，单独使用FN或L-Arg时，实验动物创面早期合成胶原和成纤维细胞的增殖较对照组加快（P＜0.05），但是联合应用组的胶原合成速度以及成纤维细胞的增殖速度则更加显著，在7天后联合应用组创面收缩明显加快，肉芽形成良好，成纤维细胞逐渐演变为纤维细胞，胶原的排列也更加整齐（P＜0.01），使创面愈合时间较对照组提前3～4天，愈合后的创面质量明显优于其余三组。其原因主要是对照组在创伤早期由于内源性的FN和L-Arg浓度较低，而联合应用组通过外源性的FN和L-Arg补充使得血浆中FN浓度增加的同时，也增加了创面局部NO的浓度，致使A、B、C三组局部的NO浓度均高于对照组，使精氨酸酶有足够的L-Arg底物分解成羟脯氨酸，进一步形成胶原，表现出促进成纤维细胞增殖和胶原合成的趋势，这种表现在联合应用组表达得更为显著。Moor dean 等报道，FN在上皮细胞培养皿表面直接促进上皮细胞粘附、扩布和表皮细胞移行。FN是创面肉芽组织的重要基质成分，可促使表皮细胞向创面中心呈定向移动。用不同动物间的皮肤做移植实验，显示了FN 在重新上皮化中的作用[4]。

在实验中我们可以看到，大鼠皮肤创面在愈合过程中NOS2的表达呈现出先高后低然后再次升高的双峰变化趋势。在伤后前3天NOS2表达是增高的，从病理切片中可见创伤部位的单核巨噬细胞、成纤维细胞等都有NOS2的表达，其中又以单核巨噬细胞的表达最为显著[5]。创伤后3～7天对照组NOS2表达有所下降，这可能是Arg经精氨酸酶水解后生成尿素和鸟氨酸，从而抑制了精氨酸酶通过增加NOS2合成NO。在创伤愈合后期，细胞内的L-Arg被NOS2耗尽后，来自巨噬细胞、角质形成细胞和成纤维细胞内的精氨酸酶表达上调且活性增强，与NOS2竞争细胞外有限的L-Arg，最终使合成的NO下降[6]。在伤后第10天NOS2表达出现第二次高峰，而在伤后14天开始下降，其原因可能是伤后第10天时创面周围组织液中的IFN-γ、IL-2等各种正向细胞调节因子增多，诱导单核巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等表达NOS2，而到愈合晚期，由于炎症反应消退使NOS2的表达亦降低。而实验组的三组中，在伤后NOS2表达只在第7～10天出现一个峰值。在炎症反应最强烈的第7～10天，高于正常量的NO诱导高于正常量的细胞因子产生，其中包括正向调节NOS2生成的因子。在这些因子的诱导下，巨噬细胞等可以大量表达NOS2[7]。随着自身炎症反应的消退以及NO的反馈性抑制作用，在愈合晚期NOS2表达下降，这些也进一步说明了损伤愈合晚期，低水平表达的NOS产生少量的NO，使精氨酸酶获得足量的L-Arg底物，分解成羟脯氨酸并进一步增加胶原的合成[8]，但精氨酸酶促进胶原合成的过程是NOS依赖性的，这种低水平表达的NOS活性对胶原的合成是必不可少的[9]。这种表现以对照组最为明显，也充分说明了由于外源性的FN和L-Arg的联合应用，能够充分发挥二者的协同作用，加快了创面的炎性反应，促进了肉芽组织及表皮的生长，从而达到使创面早期愈合的目的。

创伤后创面愈合的时间和创面愈合面积的百分比是评估一种治疗措施对创面愈合影响的一个综合性指标。本实验研究在大鼠创面愈合过程中人为的给予外源性的FN和L-Arg，其中实验组B、C较正常提前1～2天，而实验A组较对照组提前3～4天。这进一步证明FN和L-Arg的促进创面愈合作用，并显示其联合应用的优越性。

创伤修复是涉及整形外科及相关学科的重要课题，过程十分复杂，在以往的研究中，已证实FN和L-Arg具有促进创面愈合的生理功能，本实验研究将二者联合应用显示其在促进创面愈合中具有显著的协同作用，但其确切的机制尚待进一步阐明。

[参考文献]

[1]陈 龙，张其英.纤维连接蛋白与皮肤创伤的研究[J].中国法医学杂志，1996，11（3）：185.

[2]Wu G, Meininger CJ, Knabe DA, et al. Arginine nutrition in development, health and disease [J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2000,3:59-66.

[3]Alderton W K, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide syntheses structure, function and inhibition [J]. Biochem, 2001, 357: 593.

[4]谷元廷，辛时林.纤维连接蛋白与伤口愈合[J].中华医学美容杂志，1997，3（3）：166-167.

[5]仇树林，张培培，李 兵，等. 外源性一氧化氮对创伤愈合过程中一氧化氮合酶表达及瘢痕形成的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2007，11（14）：2652-2656.

[6]仇树林，张培培. 局部应用不同浓度硝普钠对创伤愈合影响的时效性研究[J].中国美容医学，2006，15（7）：768-770.

[7]许 波，吴玉章. 巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的表达调节机制[J].免疫学杂志，2002，18（3）：156-159.

[8]Pollock JS, Webb W, Callaway D, et al. Nitrooxide synthase isoform expression in a porcine model of granulation tissue formation [J]. Surg,2001, 129(3):341-350.

[9]徐永红，边 城，李丁果，等.一氧化氮对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响[J].中国药理学通报，2002，18（5）：591-592.

[收稿日期]2008-02-24[修回日期]2008-05-06