人正常泌尿系上皮细胞系作为组织工程化尿道种子细胞的可行性研究

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[摘要]目的：研究人正常泌尿系上皮细胞系（SV-HUC-1）在传代20代之后的性质变化，探讨将其作为组织工程化尿道研究种子细胞的可行性。方法：对于SV-HUC-1传代20代的细胞进行形态观察，应用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测细胞标志蛋白表达。应用Cell TrackerTMBlue CMF2HC，进行活细胞示踪研究。结果：对于第20代SV-HUC-1细胞，应用倒置相差显微镜观察生长到其形态正常。应用RT-PCR法和间接免疫荧光法均检测到第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达。应用研究活细胞示踪研究，在第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell TrackerTMBlue CMF2HC后，发现SV-HUC-1细胞生长良好。结论：SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代，形态正常，能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白，并能以活细胞的方式进行示踪和观察。SV-HUC-1细胞系是适合作为尿道组织工程实验用的种子细胞。

[关键词]SV-HUC-1；组织工程；尿道；上皮细胞系

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）03-0433-03

Study of the Possibility of Human Urethral Cell as Seed cell of Urethral Tissue Engineering

FAN Wei-wei,LV Wei,FAN Ju-feng

(Department of Plastic Surgery,Beijing Chaoyang Hospiatal of Capital Medical University,Beijing 100020,China)

Abstract: Objective To investigate the property of the 20th passage of SV-HUC-1 cell line.To study of the possibility of human urethral cell as seed cell of urethral tissue engineering. Methods We observed the morphology of the 20th SV-HUC-1 generation cell. RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing were used to detect signal protein expression of the cells. Cell TrackerTM Blue CMF2HC was used to trace the live cells. Results The morphology of the 20th SV-HUC-1 cells was normal under the inverted phase contrast microscope. Vimentin and CK-18 was detected through RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing. The 20th passage of SV-HUC-1 cells grew well after they were input Cell TrackerTM Blue CMF2HC. Conclusions The SV-HUC-1 cells can be culture to the 20th passage. They can express the signal protein of urinary epithelial cells. The morpaholgy of cells is regular. They can be investigated and traced with the live cells. The SV-HUC-1 cell line is a good choice of seed cells for urethral tissue engineering.

Key words: SV-HUC-1; tissue engineering; urethra; endothelial cell line

尿道下裂和尿道上裂的研究与组织工程化尿道的研究密切相关。但是来自人体和实验动物的成体细胞作为种子细胞的研究往往受限于种子细胞在培养传代一定代数后就会发生性质改变，从而无法进行大量传代而获得大量细胞。种子细胞的选择，成为了尿道组织工程研究的瓶颈之一。能否绕过种子细胞对于实验过程的干扰，找到为一种理论上可以反复传代而不发生变性的尿道黏膜上皮细胞作为种子细胞进行研究呢？笔者选择了人正常尿道上皮细胞系（SV-HUC-1），对其进行体外培养传代，并对其传代20代后的性质进行了检测。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞及主要试剂：人正常尿道上皮细胞系（SV-HUC-1）购自美国ATCC（产品编号CRL-9520 ）、F-12K培养基（美国Invitrogen公司）、胎牛血清（FBS）（美国HyClone公司）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）。

1.2 主要仪器：CO2恒温培养箱（日本Napco公司，型号：5410）、超净操作工作台（北京半导体设备一厂）、倒置相差显微镜（日本Olympus公司）、低速离心机（北京医用离心机厂，型号：LD4-2）、电子精密天平（上海精科天平厂，型号：FA1104）、高温烤箱（日本Sakura公司，型号：HE-21）、超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所，型号：JY-96-2）。

1.3 实验方法

1.3.1 配制主要溶液：含10%FBS的F-12K培养液，胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.02%）溶液，细胞冻存液。

1.3.2 细胞培养与传代：SV-HUC-1细胞以含10%灭活胎牛血清（FBS）的F-12K培养基在37℃、含5%CO2的培养箱内培养。每2天更换培养基，细胞生长至70%融合后用于后继实验。连续传20代，取细胞用于下一步鉴定。

1.3.3 细胞鉴定：将细胞裂解后提取总RNA，逆转录后得到cDNA，以波形蛋白（Vimentin）和角蛋白-18（CK-18）的引物进行扩增，得到相应大小的片段。以间接免疫荧光染色的方法对细胞的Vimentin和CK-18进行染色，进一步证实其蛋白的表达。

1.3.4 活细胞示踪：选择CellTrackerTM Blue CMF2HC (美国英杰公司，产品编号C12881)作为活细胞示踪剂，工作浓度为15μM，对生长至70%融合的第20代的SV-HUC-1细胞进行40min标记，然后PBS洗脱未进入细胞的示踪剂，换培养基继续培养48h后，以4%的甲醛固定。

2 结果

2.1 细胞培养：应用倒置相差显微镜观察生长至不同融合度的第20代SV-HUC-1细胞，可见其为形态正常的SV-HUC-1细胞（图1）。

2.2 细胞鉴定： 应用两种鉴定方法予以鉴定。应用RT-PCR法检测第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达。应用间接免疫荧光法检测到第20代SV-HUC-1细胞中CK-18的蛋白质表达（图2）。上述两项鉴定实验证实第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA均表达，从而明确该细胞具有的SV-HUC-1细胞的标志蛋白表达。

2.3 活细胞示踪：第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell TrackerTM Blue CMF2HC后，以荧光显微镜观察细胞的生长情况，SV-HUC-1细胞生长良好（图3）。

通过以上实验，证实了SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代，形态正常，能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白，并能以活细胞的方式进行示踪和观察。

3 讨论

国内外有许多有关组织工程化尿道的研究，直接取自人体或动物的成体膀胱黏膜上皮细胞及尿道黏膜上皮细胞等泌尿系统上皮细胞是常用的种子细胞[1-8]，也有选用表皮细胞者[9-10]。

来自泌尿系统的上皮细胞无疑是最适用于尿道组织工程的种子细胞，但是由于直接取自人体或动物的成体泌尿系上皮细胞在经历若干代传代之后往往其性质发生较大变化，所以虽然个别作者报道能够在较短时间内获得大量扩增的尿道黏膜上皮细胞用于组织工程化器官构建[11]，但是大多数国内外在应用直接取自人体或动物的成体细胞作为种子细胞的进行研究时，其传代多为10代以内[1-10]。

但是，有很多实验需要大量的细胞进行研究，需要进行大量传代而获得大量细胞；另有很多研究目的不在于种子细胞，而是集中注意力于组织工程种子细胞与材料的复合方面的研究，因此就需要找到一种可以反复传代而不发生变性的尿道黏膜上皮种子细胞，这是能够保证很多实验顺利进行下去的前提。因此有必要寻找一种能绕过成体细胞难以大量传代的障碍，绕过种子细胞对于实验过程的干扰的方法。

如何解决这个问题呢？笔者考虑到应用SV-HUC-1细胞系，这种细胞来源于泌尿系上皮细胞，其特点在于能够无限传代下去。但是多次传代后SV-HUC-1细胞能够保持其原有性质吗？还适用于进行实验研究吗？本实验对于第20代SV-HUC-1细胞，应用倒置相差显微镜观察生长到其形态正常。并检测了第20代SV-HUC-1细胞的标志蛋白表达。应用RT-PCR法和间接免疫荧光法均检测到第20代SV-HUC-1细胞中Vimentin和CK-18的mRNA表达。应用研究活细胞示踪研究，在第20代SV-HUC-1细胞中加入活细胞示踪剂Cell Tracker? Blue CMF2HC后，以荧光显微镜观察细胞的生长情况，发现SV-HUC-1细胞生长良好。

通过以上实验，证实了SV-HUC-1细胞能够正常生长传代20代，形态正常，能够表达泌尿系上皮细胞的标志蛋白，并能以活细胞的方式进行示踪和观察。从这一角度为说，SV-HUC-1细胞系是适合作为尿道组织工程实验用的种子细胞。

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[收稿日期]2011-09-25 [修回日期]2012-02-17