注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖与氧化损伤的影响
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[摘要] 目的：探讨注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的增殖与过氧化氢氧化损伤的影响。方法：采用MTT法，观察不同浓度的注射用脑蛋白水解物对体外培养的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12）生长及过氧化氢损伤保护的作用。结果：注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的增殖及氧化损伤的保护作用存在量效关系。结论：注射用脑蛋白水解物可促进PC12细胞生长，并可保护细胞减轻过氧化氢的损伤。
[关键词] 注射用脑蛋白水解物；大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞；MTT
[中图分类号] R781.4[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）04（a）-030-02
Effects of cerebroprotein hydrolysate for injection on PC12 pheochromocytoma cells proliferation and oxidative damage
JIANG Yuhui, LIANG Weiyang
Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To explore the biological effects of cerebroprotein hydrolysate for injection on the proliferation and oxidative damaged rat pheochromocytoma cells (PC12). Methods: Thiazoly blue (MTT) colorimetric assay was used to determine the proliferation and oxidative damaged protection of PC12 cells after different doses of cerebroprotein hydrolysate for injection were added into the culture medium. Results: The proliferation and protection effects on PC12 cells of cerebroprotein hydrolysate for injection were depended on its doses. Conclusion: Cerebroprotein hydrolysate for injection may promote the proliferation and protect the PC12 cells injured from oxidation.
[Key words] Cerebroprotein hydrolysate for injection; Rat pheochromocytoma cells; MTT
注射用脑蛋白水解物为健康乳猪脑经酶水解制成的无菌冻干制剂，含75%~80%游离氨基酸和20%~25%小分子肽。它具有良好的健脑、益智、修复脑损伤的功效，临床上可用于神经系统疾病特别是阿尔茨海默病的治疗，是近年来应用最多的生化药物之一[1-2]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）是体外神经细胞增殖、损伤及保护作用研究使用最为广泛的细胞系[3]。注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的体外影响，国内外少见报道。本文旨在探讨注射用脑蛋白水解物对PC12细胞增殖和过氧化氢诱导损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株大鼠肾上腺PC12细胞株购自上海细胞生物所。
1.1.2 药物与试剂注射用脑蛋白水解物（广东阳江制药厂有限公司产品，批号为100401）；药用级氨基酸（杭州华锦药业有限公司）；RPMI 1640培养液（Gibco，USA）；小牛血清（广州鼎国生物技术有限公司）；胰酶（Gibco，USA）；噻唑蓝（MTT，Amersco，USA）；过氧化氢（广州化学试剂厂）。
1.1.3 主要仪器生物安全柜（Nuaire，USA）；二氧化碳培养箱（Sanyo，Japan）；倒置相差显微镜（Olympus，Japan）；紫外可见光连续光谱仪（Molecular Devices，USA）。
1.2 方法
1.2.1 接种细胞取对数生长期的PC12细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，以105个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2的无菌培养箱中培养4 h，待细胞贴壁后进行增殖和损伤实验。
1.2.2 细胞增殖实验96孔板内细胞分为对照组、氨基酸组和4个实验组，每组6孔。对照组加入10%小牛血清-RPMI 1640培养液；实验组分别加入含不同浓度注射用脑蛋白水解物（含氮量5、50、100、300 mg/L）的10%小牛血清-RPMI 1640培养液；氨基酸组加入按照注射用脑蛋白水解物质量标准[4]中氨基酸含量配制的氨基酸溶液，每孔100 μl，培养48 h，进行MTT检测。
1.2.3 细胞损伤实验96孔板内细胞分为对照组、损伤组、氨基酸组和4个实验组，每组6孔。对照组、损伤组加入10%小牛血清-RPMI 1640培养液，实验组和氨基酸组按“1.4.1”中加入样品，每孔100 μl，培养24 h。损伤组、氨基酸组、实验组加入0.5 mmol/L H2O2，对照组加入10%小牛血清-RPMI 1640培养液，每孔50 μl，继续培养48 h。
1.2.4 MTT检测培养结束前4 h，取出培养板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100 μl，混匀，连续光谱仪上测OD值，波长490 nm。
1.3 统计学处理
数据以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 注射用脑蛋白水解物对细胞增殖的影响
与对照组比较，注射用脑蛋白水解物对PC12细胞具有明显的促增殖作用（P
表1 注射用脑蛋白水解物对PC12细胞增殖的影响（x±s）
注：与对照组比较，*P
2.2 注射用脑蛋白水解物对过氧化氢损伤细胞的影响
0.5 mmol/L的H2O2对PC12细胞具有损伤作用（P
3 讨论
PC12细胞从胚胎发生学来看，它源于生成神经系统的外胚层，故具有某些神经元的特征，在实验研究中可以作为神经元的替代细胞并且易培养可传代，确保量化评估效果，是一个比较理想的药效评价的细胞模型[5]。选用H2O2作为损伤因子，不仅可以简化实验条件和操作步骤，而且更主要的是H2O2代表了机体自由基产生的重要环节，可以模拟脑缺血再灌注时产生的自由基损伤。H2O2的产物具有很强的氧化性并可自由进入细胞，破坏细胞内活性氧和抗氧化代谢的平衡，使抗氧化酶如SOD等活性下降，同时会损伤体内脂质、蛋白质和DNA等生物大分子，造成细胞内酶活力变化、代谢紊乱、DNA损伤和细胞凋亡[6]。
注射用脑蛋白水解物是一种广泛使用的具有神经保护和神经营养作用的药物，用于缓解多种神经系统疾病的症状，特别是改善阿尔茨海默病等神经退行性痴呆和中风后遗症。外源性的脑蛋白水解物可跨越生物膜，包括血脑屏障，促进细胞的代谢调节功能，其作用机制可能为提高脑组织无氧代谢的三磷酸腺苷(ATP)生成量，减少氧自由基生成，增加组织对氧的利用，调节脑内兴奋性物质和抑制性物质的平衡等[7]。
本研究结果表明，注射用脑蛋白水解物不仅可以促进PC12细胞增殖，而且对H2O2损伤的细胞具有保护作用，并且药物浓度越大，作用越明显。此外，我们还发现按照注射用脑蛋白水解物质量标准中氨基酸含量配制而成的氨基酸溶液对PC12细胞并无促增殖和损伤保护的作用，这说明脑蛋白水解物中具有生物学活性的主要是多肽，这与前人的研究结果一致[8]。本文以稳定传代的PC12细胞为模型，脑蛋白水解物对其的效应具有剂量依赖性，因此可用于检测药物活性，并作为药物的药效评价模型。
[参考文献]
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[4]国家药品监督管理局国家药品标准[S].WS1-(X-018-2001Z）.
[5]梁毅,李红珂,林双峰,等.神昌注射液对谷氨酸诱导损伤PC12细胞的保护作用[J].卒中与神经疾病,2010,17(1):23-25.
[6]Butterfield DA, Reed T, Shelley F, et al. Roles of amyloid β-peptide-associated oxidative stress and brain protein modifications in the pathogenesis of Alzheimer's disease and mild cognitive impairment [J]. Free Radical Biology and Medicine,2007,43(5):658-677.
[7]Tapu M, Bicu D, Tapu F, et al. The efficacy of cerebrolysin in vascular dementia [J]. J Neuro Sci,2009,283(1-2):286.
[8]Hartbauer M, Hutter Paiter B, Skofitsch G, et al. Antiapoptotic effects of the peptidergic drug Cerebrolysin on primary cultures of embryonic chick cortical neurons [J]. J Neural Transm, 2001,108:459-473.
（收稿日期：2011-01-11）