脾阴虚痴呆证病结合模型建立及滋补脾阴方药干预的实验研究
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摘要：目的：为有效模拟临床，建立脾阴虚痴呆证病结合大鼠模型。并观察滋补脾阴(zi－Bu－Pi－Yin，ZBPY)方药对其影响。方法：采用经典方法建立脾阴虚模型，随后将凝集态p－淀粉样蛋白1－40(B―Amyloid l－40，AB.40)定位注射到双侧海马，应用ZBPY方药干预，观察各组体征变化。通过跳台仪和Morris水迷宫进行行为学测试，比较各组学习记忆能力的改变。结果：脾阴虚组和脾阴虚痴呆组表现出饮水量增加(.P
关键词：阿尔茨海默病；脾阴虚；滋补脾阴；学习记忆
中图分类号：R－33 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2008)01－0009－04
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人最常见的一种神经退行性疾病，以严重的记忆力减退和认知功能障碍为主要临床表现。为有效模拟临床，客观评价滋补脾阴(ZBPY)方药的治疗效果，本研究建立脾阴虚痴呆证病结合大鼠模型，予以ZBPY方药干预，观察其对模型的干预效果。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠35只，体重(200±20)g，鼠龄6―8周，购自上海西普尔一必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2003－0002。
1.2 试剂和药物
B－淀粉样蛋白l 40(B―Amyloid l－40，ABI－40)购自美国Signm公司。伤阴药(吴茱萸、附子、肉桂)和ZBPY方药(人参、山药、白芍、扁豆、茯神、檀香等)均一次性购自大连美罗医药公司，常规水煎，过滤后4℃冰箱保存备用。
1.3 主要仪器
MC－106B电子体温计为日本OMRON公司制造；Model 5000 Micro injectlon Unit脑立体定位仪购自美国KO－PF公司；OTr－2跳台仪、DMS－2 Morris水迷宫测试与记录系统由中国医学科学院药物研究所研制。
2 方法
2.1 动物分组
将大鼠适应性喂养5天后，随机分为空白对照组、痴呆组、脾阴虚组、脾阴虚痴呆组和脾阴虚痴呆+ZBPY组，共5组(n=7)。
2.2 模型建立
脾阴虚证模型的建立参照经典的复合因素造模法，分为脾气虚和脾阴虚两个阶段。实验第1－15天为脾气虚阶段，模型组单日自由游泳达到耐力极限，禁食饲料，喂食甘蓝(30g／只)；双日予猪油脂每只1.5 mL／100g体重灌服。其余组正常喂养。予等量生理盐水灌服。第16－24天为脾阴虚阶段，在脾气虚的基础上每日增加伤阴药每只lmL／100g体重，连续灌服。其余组予等体积生理盐水灌服。参照文献[1]将符合脾阴虚标准的模型大鼠进行痴呆模型的建立。用MilliQ水将Ap－40稀释成5p,g／uL，37℃孵育1周，使其变为聚集状态备用。实验第25天，大鼠经腹腔注射2％戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉后，固定到脑立体定位仪，常规备皮消毒，切开皮肤；选择双侧海马为注射靶区，定位坐标参照Paxinos and Watson大鼠脑立体定位图谱，取前囟后3.5mm，中线旁2.0mm，门齿钩平面低于耳间线平面3.3mm处钻开颅骨，暴露硬脑膜。微量注射器自脑表面缓慢垂直进针至硬脑膜下2.7mm。痴呆各组每侧予以2ulAB－40溶液缓慢注入，留针5min以保证溶液充分弥散，缓慢撤针，缝合切口，皮下注射抗生素防止感染；其余组注入等体积MIIUQ水。术后继续喂养，1周后进行行为学测试。
2.3 脾阴虚证的观察指标
每天观察大鼠的活动状态、背毛色泽变化、粪便性状；每天上午定时称体重、测量肛温；各组分笼喂养，统计每只大鼠平均饮水量和食量。
2.4 药物干预
白海马微量注射术后至行为学检测完毕，脾阴虚痴呆+ZBPY组给予ZBPY方药14g,／kg，每日每只lmL／100g体重，灌胃。其它各组每日予生理盐水等体积量灌胃。
2.5 行为学测试及观察指标
2.5.1 跳台测试将大鼠放人箱中自由活动5rain熟悉环境，然后将箱底的金属杆通以电流，其正常反应是跳上橡胶制的平台以躲避伤害性刺激。记录大鼠首次跳到平台的时间(反应期)和5min内大鼠跳到金属杆上的次数(错误次数)，作为学习成绩。24h后重复试验，将大鼠放到平台上并同时通电，记录其第一次跳下平台的时间(潜伏期)和5min内的错误次数，从而反映大鼠的记忆保持能力。
2.5.2 Morris水迷宫测试连续训练5天，第1天为适应性训练，将池中平台撤去，使大鼠在池中自由游泳120s，以后4天每天训练4次，每次训练间隔60s。训练时随机选择一个入水点入水，将大鼠面向池壁放入水中，迫使大鼠学习寻找设于水面以下的平台。记录120s内寻找平台所需时间(潜伏期)。如果大鼠入水120s内未能找到平台，则将其引导至平台，并在平台停留60s，潜伏期记录为120s。
2.6 统计方法
所有数据用x±5表示。实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析。多组间均数比较采用单因素方差分析；两组间均数比较采用t检验。显著性标准界值均定为P
3 结果
3.1 各组大鼠体重肛温进食量饮水量的变化
3.1.1 脾气虚模型阶段脾气虚各组从第2天开始即出现体形逐渐消瘦，与空白组相比这3组体重均明显下降(p
3.1.2 脾阴虚模型阶段脾阴虚各组在施加伤阴药后，逐渐出现易激惹、咬斗，与同月龄对照组相比，体重下降明显(P
脾气虚及脾阴虚阶段，痴呆组与空白对照组相比，各项观测指标无明显差异，脾阴虚组、脾阴虚痴呆组、脾阴虚痴呆+ZBPY组3组间进行比较无显著性差异。
3.1.3 证病结合模型阶段以及ZBPY方药的干预作用海马注射术后，脾阴虚痴呆+ZBPY组经方药干预后激惹程度减轻，背毛较前光泽，与脾阴虚痴呆组相比，体重略有
上升，肛温降低(P
3.2 学习记忆成绩测试
3.2.1 跳台测试HT 各组大鼠于术后1周进行跳台测试，结果显示痴呆组和脾阴虚痴呆组反应期延长。错误次数增多，学习记忆成绩明显低于空白对照组(P
3.2.2 水迷宫测试各组大鼠潜伏期的变化见表5和图1。每组不同时间点之间均有显著性差异(P
4 讨论
证病结合模型的建立是继承、发展中医以及实现中医现代化的基础，是中西医结合研究的重要环节，对深层次探讨中西医理论的内在联系具有重要意义。目前在方剂疗效的实验研究中，动物模型多数为模拟现代医学发病原理进行复制的模型。此类模型证候所属难以确定，而中医诊治的基本思想是辨证论治，因此中药复方的特色及优势在动物实验中很难得到体现和发挥。方证对应是临床遣药用方的基本思维模式，因而建立证病结合动物模型是中药复方研究的可行途径。
AD是发生于老年期的神经系统变性疾病，老年斑(se－nile plaqucs，SP)是AD患者脑中的重要病理改变之一，而AB又是sP的核心成分。目前研究认为AD发病原因是大脑皮层及脑区细胞间隙的AB通过多种途径引发促进神经元细胞凋亡和细胞内多聚Tau蛋白沉积，并且通过免疫注射清除B－淀粉样斑块后，其引起AD的神经系统病变可以得到修复，这为AB学说提供了有力的证据，说明淀粉蛋白沉积是AD发病的中心环节。因此本实验中“痴呆”模型的建立方法是通过在大鼠的海马内立体定向注射聚合态的AB－40来实现。
学习是神经系统接受环境的变化而获得新行为习惯的过程。记忆是学习后经验的储存和保持。大量资料显示AD患者由于种种病理基础而出现学习记忆障碍。此研究中痴呆组与脾阴虚痴呆组均表现为学习记忆能力低于空白对照组。恰恰验证了这一机制。脾阴虚痴呆组在水迷宫测试中学习记忆成绩表现比痴呆组略低，但没有统计学差异，推测可能与脾阴虚后整体状态下降，行动迟缓有关。脾阴虚痴呆+ZBPY组的行为学测试结果明显高于脾阴虚痴呆组，与空白对照组相比未见明显差异，提示ZBPY方药对AD的学习记忆能力起到了一定改善作用。
本研究使脾阴虚证与阿尔茨海默病的模型相结合，既运用了中医的发病学说，又考虑了西医的致病原理，综合了两类模型的特点而建立的动物模型。实验结果显示痴呆组和脾阴虚痴呆组的学习记忆成绩明显降低，脾阴虚痴呆组除了行为学测试发生改变外，还可见江温升高，饮水量增加等阴虚内热的表现。通过ZBPY方药干预，脾阴虚表现明显好转，学习记忆能力也得到了显著提高，这不仅验证了实验模型的成功建立，更加肯定了ZBPY方药对脾阴虚痴呆的治疗效果。
中医学认为脾主运化水谷、升主阳气，而清阳之气上升于脑，头为诸阳之会。气血精津是脏腑活动的物质基础，只有精血旺盛，心神得养，脑髓得荣，学习记忆能力才强。万物皆分阴阳，脾之亦然。脾阴虚则影响机体水谷的运化和血脉的滋生，而老年人阴血耗损不足，且无以化生，终至髓减脑消神机失用，渐至痴呆。ZBPY方药是笔者以清代吴澄《不居集》的资成汤为基础并结合多年实践化裁而成。
本课题组以往的研究证实脾阴虚与机体能量代谢障碍之间关系尤为密切，ZBPY方药具有显著调节脑线粒体膜磷脂代谢障碍和膜修饰作用，从而保障能量代谢的顺利进行，延缓脑衰老。ZBPY方药对脾阴虚痴呆学习记忆的改善是通过多靶点、多途径而发挥作用的，为进一步深入探讨其作用机制提供了依据。