高效液相色谱法对甘利欣注射液中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量测定

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摘 要：目的：用RP-HPLC法测定甘利欣注射液中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。方法：采用ZORBAX Extend C18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）；乙腈-磷酸盐缓冲液（pH=7：20：80）为流动相；检测波长250nm；流速1mL•min-1；柱温为30℃。取混合对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，以混合对照品溶液色谱图中18α-甘草酸和18β-甘草酸的峰面积（3次平均）外标法计算甘利欣中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。结果：18α-甘草酸和18β-甘草酸分别在0.1010~ 1.0100μg（r=0.99984）和0.1033~1.0330μg（r=0.99948）范围内呈线性；18α-甘草酸和18β-甘草酸加样回收率和RSD分别为98.02%、RSD=0.35%和97.5%、RSD=0.54%。结论：对于提高甘利欣注射液药品质量标准，该方法更加简便、可靠、准确，具有定性、定量双重意义。

关键词：甘利欣；18α-甘草酸；18β-甘草酸；RP-HPLC；含量测定

中图分类号：R284.1文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)11-2512-03

Determination of 18α-Glycyrrhizic Acid and 18β-Glycyrrhizic Acid in

Diammonium Glycyrrhizinate Injection by RP-HPLC

LIU Jincheng1,HANG Qing2,ZHANG Dingshan2

(1.The Sixth People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310014,Zhejiang,China;2.Precaution and Health Maintenahce Department of Hangzhou,Hangzhou 310014,Zhejiang,China)

Abstract:Objective: To determine the contents of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid in Diammonium Glycyrrhizinate Injection by RP-HPLC. Methods:The Chromatographic method was carried out on ZORBAX Extend C18 column using acetonitrile-phosphate buffer solution(pH=7∶20∶80 ) as a mobile phase. The detection wavelength at 250nm.The flow rate was 1mL•min-1.The column temperature was 30℃. Took control solution mixture and experimental solution,poured in chromatograph of liquid respectively, with peak area external reference method of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid in control solution mixture chromatogram, to determined the contents of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid.Results:The 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid calibration curves were linear at the of 0.1010~ 1.0100μg（r=0.99984）and 0.1033~1.0330μg（r=0.99948）.The average recoveries were 98.02% with RSD 0.35% for 18α-glycyrrhizic acid and 97.5% with RSD 0.54% for 18β-glycyrrhizic acid.Conclusion:This method is simple, reliable and provides a reference standard for the quality control of Diammonium Glycyrrhizinate Injection.

Key words:Diammonium Glycyrrhizinate Injection;18α-glycyrrhizic acid ;18β-glycyrrhizic acid;RP-HPLC;Contentdetermination

甘利欣为甘草酸立体异构体混合物制剂，临床上主要用于肝病的治疗，且具有较好的抗肝损害作用。其主要成分甘草酸二铵（含18α-甘草酸70%~73%，18β-甘草酸27%~30%）的含量测定方法主要为紫外分光光度法[1-2]，测定结果为甘草酸立体异构体混合物的含量。由于无法标示18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量，因此在制剂质量控制上存在诸多不确定因素。本实验依托2005版《中华人民共和国药典》一部甘草酸含量测定（附录VID）项下操作思路，采用RP-HPLC法同时测定18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。利用双含量来控制、提高制剂的内在质量；为该药品标准的进一步研究，提供一个分离度高、灵敏、准确的参考方法。

1 仪器与试药

1.1仪器Agilent 1100系列液相色谱仪、四元泵、在线真空脱气、DAD检测器、化学工作站、1200型自动进样器。1.2试药18β-甘草酸（18β-Glycyrrhizic acid）对照品，为甘草酸铵（新疆天山制药工业有限公司）；18α-甘草酸(18α-Glycyrrhizic acid)对照品为自制18α-甘草酸铵，纯度：HPLC>98%（杭州市第六人民医院药物实验室）；甘利欣注射液（Diammonium Glycyrrhizinate Injection）样品（江苏正大天晴药业股份有限公司）；乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾、氢氧化钾（分析纯），水（双蒸水）。

2 实验方法与结果

2.1色谱条件美国ZORBAX Extend- C18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）为固定相；乙腈-磷酸盐缓冲液（pH=7,20∶80）为流动相；检测波长250nm[3]；流速1mL•min-1；柱温为30℃。柱效以18β-甘草酸计，理论塔板数不应低于2000。结果被测组分可在9min内出完，二元等度洗脱全程为0~20min。记录的色谱图按保留时间先后出峰顺序为18β-甘草酸、18α-甘草酸，结果见图1。

图1对照品与样品色谱图

2.2对照品溶液的制备分别取80℃干燥至恒重的18β-甘草酸和18α-甘草酸各0.1g，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，使成每毫升含有18β-甘草酸1mg和18α-甘草酸1mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密吸取甘利欣注射液1mL，转移至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4 测定方法取混合对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，进样10μL，记录色谱图，以混合对照品溶液色谱图中18α-甘草酸和18β-甘草酸的峰面积（3次平均）外标法计算甘利欣中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量（%，W/W）。

2.5 线性关系精密吸取混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mL于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度比的系列溶液，分别进样10μL，测定各组分的峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。18α-甘草酸回归方程为Y=3.41546X+2.05770，r=0.99984,线性范围0.1010~1.0100μg；18β-甘草酸回归方程为Y=2.95951X+2.88609，r=0.99948，线性范围0.1033~1.0330μg。

2.6 精密度试验取供试品溶液与上述色谱条件下进样10μL，重复5次，以被测组分峰面积分别计算，结果18α-甘草酸：RSD=0.37%,18β-甘草酸：RSD=0.66%。

2.7 稳定性试验取供试品溶液，分别于0、2、4、6、12h进样10μL，记录峰面积，结果18α-甘草酸：RSD=0.85%,18β-甘草酸：RSD=1.21%(n=5)。

2.8 重现性试验取同一批号的甘利欣，按“2.3项”下制备5份供试溶液，分别进样10μL，记录峰面积，结果18α-甘草酸：RSD=0.93%,18β-甘草酸：RSD=1.25%。

2.9 回收率测定精密量取已知含量的甘利欣样品一式5份（1mL×5），置10mL量瓶中，分别精密加入一定量的18α-甘草酸和18β-甘草酸混合对照品溶液，按“2.3项”下方法制备,依“2.4项”下方法测定，记录峰面积并计算回收率，18α-甘草酸平均回收率为98.02%，RSD=0.35%，18β-甘草酸平均回收率为97.5%，RSD=0.54%,结果见表1。

2.10 样品测定取6批同一厂家生产的甘利欣（规格：50mg/10mL），按2.3项下方法制备，依2.4项下方法测定，平行测定3次，结果见表2。

3讨论

3.1被测组分的选择甘利欣的主要成分为甘草酸二铵，相关文献[4-5]视其为18α-甘草酸制剂。其实甘利欣是以18α-甘草酸为主、18β-甘草酸为辅的立体异构体混合物制剂。由于两种甘草酸分子构型不同，药理作用、不良反应及临床疗效也存在相当的差异性[6]，从检测角度考量，选择同时测定18β-甘草酸和18α-甘草酸的含量不仅必要，而且具有定性、定量双重意义，因此本实验选择18β-甘草酸和18α-甘草酸作为被测组分。

3.2流动相的选择本实验采用RP-HPLC二元等度洗脱法，选择乙腈-磷酸盐缓冲液（pH=7∶20∶80）作为流动相，是基于甘草酸立体异构体对二元等度洗脱系统的适应性考量。甘草酸为五环三萜（齐墩果烷型）类化合物，立体异构体间仅为C18-H的构型不同，且成分明确，因此只要选择适宜的洗脱溶剂系统，促使甘草酸立体异构体混合物分配系数较大，就能达到基线分离的效果，使色谱图具有化学图谱的“完整面貌”，综合反映制剂质量信息。由系统适应性试验表明，在本实验RP-HPLC二元等度洗脱系统条件下，记录的色谱图中，18α-甘草酸和18β-甘草酸分离度符合要求。既可排拆干扰，又能使被测组分达到基线分离的效果，避免分不开或出峰时间相差过大及基线漂移的问题，且分析时间较短。

甘利欣是肝病的常用药之一，主要用于伴有谷丙转氨酶升高的慢性迁延性肝炎及慢性活动性肝炎。本品具有较强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。药理实验证明,小鼠口服本品能减轻因四氯化碳、硫代乙酰胺和D-氨基半乳糖引起的血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶升高。本品还能明显减轻D-氨基半乳糖对肝脏的形态损伤和改善免疫性因子对肝脏形态的慢性损伤。然而对甘利欣制剂质量控制上却存在诸多不确定因素，本实验通过对线性关系、精密度试验、稳定性试验、回收率测定、样品含量测定等方面考察，认为高效液相色谱法测定甘利欣注射液中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量更加简便、可靠、准确，对于提高甘利欣注射液药品质量标准具有定性、定量双重意义。

参考文献

［1］ 国家医药管理总局.中华人民共和国卫生部部标准（试行）［S］.北京：中国标准出版社，1985.

［2] 赖瑛，王佩.3种紫外分光光度法测定甘草酸二铵含量的比较[J].中国药业，2004，13（12）：46.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2005：323.

［4］ 范益，丁建花，刘苏怡，等.α-与β-甘草酸在小鼠体内分布的研究[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（6）：619.

［5］ 张剑峰，张丹参.甘草酸药理作用的研究进展[J].河北北方学院学报，2005，22（4）：81.

［6］ 徐会选.甘草酸类药物的不良反应[J].药物不良反应杂志，2003，5（3）：170.