水稻类受体激酶CRINKLY4胞外结合蛋白的研究
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摘要：水稻类受体激酶ＣＲＩＮＫＬＹ４参与了植物细胞的增殖和分化。为了寻找ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外结合蛋白，采用了水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域作为诱饵蛋白，酵母双杂交筛选两周的小苗ｃＤＮＡ文库。结果得到许多靶标蛋白，其中一个水通道蛋白质值得关注。
关键词：水稻；类受体激酶；酵母双杂交
中图分类号：Ｑ２９１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2982-03
Study on Extracellular Binding Proteins of crinkly4 in Rice
ＹＡＯ Ｑｉｎｇ－ｇｕｏ，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｑｉｎ，ＺＨＯＵ Ｅｒ－ｐｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｊｕａｎ，ＦＥＮＧ Ｊｕｎ－ｘｉａ
（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００３５，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＲＩＮＫＬＹ４ ｗａｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｌａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ａ ｗｉｄｅ ａｒｒａｙ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｔｏ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＲＩＮＫＬＹ４， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＲＩＮＫＬＹ４ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｂａｉｔ ｉｎ ａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｎｏｔａｂｌｅ ｉｎｔｒｕｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ； ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ； ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ
ＣＲＩＮＫＬＹ４属于肿瘤坏死因子类受体激酶，是最早在玉米中被发现的，后来在拟南芥和水稻中发现其同源的蛋白质，统称为ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白质家族［１］。ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白质家族类受体激酶在玉米叶片和侧根发育中发挥着重要的作用［２］。存在于质膜上的ＣＲＩＮＫＬＹ４可能接受胞外某种发育的信号，决定细胞分化的命运，到目前为止，ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白质家族类受体激酶在植物中的功能研究已经相当深入，但对于它的信号通路知之较少。以水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域为诱饵，通过酵母双杂交，试图筛到与水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的蛋白质。
１材料与方法
１．１材料
水稻品种为日本晴，水稻小苗种植在温室中（１４ ｈ光照，１０ ｈ黑暗，２８ ℃左右），建文库所提取的ＲＮＡ来自生长两周的水稻小苗叶片。酵母菌株ＡＨ１０９购自美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。所用培养基均按照《分子克隆实验指南》第三版配制，灭菌后按比例加入所需抗生素。
１．２方法
１．２．１文库的构建和筛选采用美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司酵母双杂交试剂盒构建和筛选酵母双杂交文库，按照其酵母双杂交系统操作手册进行。ＣＲＩＮＫＬＹ４由９０１个氨基酸残基组成，编码区全长２ ７０６ｂｐ，ＳｉｇｎａｌＰ ３．０分析信号肽断裂位点位于Ｎ－端２２位甘氨酸和２３位亮氨酸之间；ＴＭＨＭＭ ２．０分析跨膜域位于Ｎ－端４２４到４４６位氨基酸，选取Ｎ－端２４到４２１位氨基酸的核苷酸序列构建到筛库的ＢＤ诱饵载体上形成ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４。扩增水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域的引物，Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ为Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ，Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ为Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｃ，测序正确的质粒进行后续的筛库实验。
１．２．２生物信息学分析氨基酸序列比对采用ＢｌａｓｔＰ；信号肽分析用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０；跨膜域分析采用ＴＭＨＭＭ ２．０。
２结果与分析
２．１酵母双杂交筛选阳性克隆
将文库ｃＤＮＡ样品、ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ和ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４共转化酵母感受态细胞，摇培后将共转化混合物（约６ ｍＬ）涂在四缺培养基上（直径１５ ｃｍ平板约涂１５０ μＬ左右菌液）；３０ ℃恒温培养，２～３ ｄ后，可见一些克隆，平板继续培养８ ｄ，使生长较慢的克隆出现（图１ａ）。筛库共有１１６个克隆长出，将这些克隆划线到新的四缺培养基上（图１ｂ），连续划线４次以上，在此过程中有许多克隆不再生长，推测为假阳性克隆，将仍能够在四缺培养基上生长的阳性克隆，进行后续β－半乳糖苷酶活性（β－Ｇａｌ）检测（图１ｃ），显较深的蓝色的有８７个，还有颜色较浅甚至不显色但在四缺培养基上生长的，推测显色比较弱的克隆可能存在着比较弱的相互作用。
提取β－Ｇａｌ检测为阳性的８７个酵母克隆的质粒，通过电击法转化到大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素（Ａｍｐ）的抗性平板上筛选，从单克隆大肠杆菌中提取质粒，用Ｂａｍ ＨⅠ和Ｅｃｏ ＲⅠ双酶切鉴定阳性克隆质粒，阳性克隆质粒与质粒ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４一对一共转化酵母，筛选出在四缺培养基上仍生长且β－Ｇａｌ检测为阳性的克隆总共６４个，将克隆对应质粒中外源片段进行测序，引物为Ｔ７，测序得到非重复的１９个核苷酸序列，将与ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ阅读框融合的氨基酸序列，输入蛋白质数据库进行搜索，得到的结果如表１。
２．２ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６的相互作用的验证
为了验证ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６（Ｐｌａｓｍａ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＩＰ）之间的相互作用，采用泛素系统进行了验证。图２中ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６分别转化酵母后在一缺培养基上生长，在二缺培养基上杂交，在四缺培养基上划线生长，挑菌落在滤纸上进行β－Ｇａｌ染色。通过图２和表２可以看出，在泛素体内试验中，ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６单独都没有自激酶活性，ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６共同转化酵母，可以在四缺培养基上生长，同时β－Ｇａｌ染色显示蓝色，更进一步说明在泛素系统的体内实验中ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６可以相互作用。
３讨论
３．１通过酵母双杂交筛选与ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的蛋白质
通过序列比对发现，水稻中的ＣＲＩＮＫＬＹ４与玉米中的ＺｍＣＲ４高度同源（８７％）［２］，ＺｍＣＲ４参与了玉米叶片表皮细胞的分化和种子糊粉层的形成过程［１］，而且前期的工作也表明，ＣＲＩＮＫＬＹ４基因的ＲＮＡｉ植株叶片卷曲而且结实率下降，推测ＣＲＩＮＫＬＹ４在水稻中可能发挥与ＺｍＣＲ４相似的生物功能。
ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外具有ＴＮＦ受体的结构域和７个卷曲重复结构，属于水稻质膜上的ＴＮＦ型的受体激酶［４］。在动物中，肿瘤坏死因子通过与质膜上的受体结合而传递细胞死亡的信号，因此推测ＣＲＩＮＫＬＹ４很可能与胞外的多肽或蛋白质结合而发挥功能，胞外的ＴＮＦ受体样结构可能是与胞外多肽或蛋白质结合的结构域［１］。近期的研究发现拟南芥中与ＣＲＩＮＫＬＹ４同源的蛋白质ＡＣＲ４胞外的７个卷曲重复序列与ＡＣＲ４功能的行使密切相关，缺失卷曲重复序列的ＡＣＲ４突变体恢复株系中，不会恢复突变体的表型［４］。ＡＣＲ４中氨基酸的突变使形成二聚体的可能性增加很多，ＺｍＣＲ４和ＡＣＲ４的跨膜域在体内都可形成同源二聚体而发挥其生理功能［２］。２０１０年Ｓｔｏｋｅｓ［５］更加详细地突变ＣＲＩＮＫＬＹ４和
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ＡＣＲ４跨膜域的氨基酸，发现ＣＲＩＮＫＬＹ４跨膜域的前１２个氨基酸对二聚体的形成至关重要。推测ＣＲＩＮＫＬＹ４可能与胞外的多肽、蛋白质相互作用来进行信号转导，因此采用ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域为诱饵，筛选水稻的小苗的ｃＤＮＡ文库，试图寻找胞外的与之相互作用的多肽、蛋白质。
筛库得到的阳性克隆进行测序发现插入到ＡＤ质粒的部分往往不是基因的全长［７］。在筛库后进行ＡＤ质粒测序发现，插入到ＡＤ质粒的大部分为基因３’端的部分，推测可能是由于在反转录前纯化ＲＮＡ的步骤比较多导致ｍＲＮＡ的断裂，只有从３’末端断裂的ｍＲＮＡ片端有PｏｌｙＡ的结构，而采用的反转录合成第一链所用引物的序列为５’－ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ ｄ（Ｔ）３０－３’，引物除含有同源重组位点外还含有３０个Ｔ的序列，反转录时引物所结合的位置为ｍＲＮＡ的３’末端的多聚Ａ，因此只有含多聚Ａ的从３’末端断裂的ｍＲＮＡ才能和引物结合，而得到的反转录产物在酵母体内同源重组到ＡＤ中，由此可见，在文库构建中优化ｍＲＮＡ的纯化条件、保持ｍＲＮＡ的完整性是保证库容量的关键。
３．２ＣＲＩＮＫＬＹ４与ＯｓＰＩＰ２－６的关系
长期以来，普遍认为细胞内外的水分子是以简单扩散的方式透过脂双层膜的。ＣＨＩＰ２８是从血红细胞中克隆的第一个水通道蛋白质［６］。其后科学家陆续从哺乳动物、植物、微生物中鉴定出各种水通道蛋白质。植物水通道蛋白质控制木质部液流在叶肉中的卸载，决定木质部液流和蒸腾流的通路，因此水通道蛋白质参与了细胞间的快速跨膜运输、细胞的生长分化和逆境胁迫等许多生理过程［７，８］。ＣＲＩＮＫＬＹ４是细胞质膜上的一个受体激酶，ＣＲＩＮＫＬＹ４家族类受体激酶在玉米、拟南芥和水稻的发育过程中发挥着重要的作用，推测存在于质膜上的ＣＲＩＮＫＬＹ４可能接受胞外某种环境的信号，跨膜信号转换传递给水通道蛋白质ＯｓＰＩＰ２－６，从而引起细胞的一系列生理反应，影响植物的生长发育。
通过酵母双杂交筛库方法筛选到与ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的一系列蛋白质，其中水通道蛋白质ＯｓＰＩＰ２－６是比较引起关注的，它们的亚细胞定位以及在生物体内是否与ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域真正相互作用，是下一步研究要解决的问题。
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