肉毒毒素时间依赖性抑制单发电刺激坐骨神经引起的腓肠肌收缩

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[摘要] 目的 分析0.75-5 U A型肉毒毒素（BoNT-A）对电刺激坐骨神经引起蟾蜍腓肠肌单收缩作用。 方法 蟾蜍随机分为琥珀胆碱组（SC，n = 44）：右侧腓肠肌注射SC 0.04 mg，左侧注射0.2 mL任氏液（RGS）；BoNT-A组（n = 42）：右侧腓肠肌分别注射0.75-5.0 U BoNT-A，左侧注射RGS。注射后分别于1、4、7、10、24、48 h制备坐骨神经腓肠肌标本，单电刺激（0.5 Hz，2 V）神经引腓肠肌等长收缩并经张力换能器计算机进行记录张力变化。 结果 1～48 h SC仅第1小时抑制电刺激坐骨神经引发的腓肠肌单收缩；1.25、2.5、5.0 U BoNT-A 1～48 h均显著抑制电刺激坐骨神经引发的腓肠肌单收缩（P < 0.05或P < 0.01），该抑制作用在10～48 h比1～7 h更强（P < 0.05）。1.25 U BoNT-A抑制效应显著，而随后剂量递增并不显著增强抑制效应。 结论 BoNT-A呈时间依赖性抑制电刺激引起对骨骼肌但收缩，其有效剂量为1.25 U。

[关键词] 肉毒毒素；琥珀胆碱；任氏液；电刺激；骨骼肌

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0020-03

A型肉毒毒素（botulinum toxin type A，BoNT-A）目前可用于临床治疗肌痉挛等神经肌肉紊乱症状、腺体分泌过多症状、疼痛及美容外科领域[1-2]。BoNT-A抑制突触前膜神经递质释放，随着神经芽生和运动终板的功能连接，神经传导和肌肉活动逐步恢复[3-6]。重复注射BoNT-A，仍产生肌松弛作用[5]，但伴随时间和注射次数增加免疫效果逐现，抗体产生可导致使用效果降低或减弱，以至于无效[7-8]。该研究利用蟾蜍，琥珀胆碱 （suxamethonium chloride，SC）为阳性对照，任氏液（Ringer′s solution，RGS）为阴性对照，探究BoNT-A对电刺激坐骨神经引发蟾蜍腓肠肌单收缩的作用，观察分析BoNT-A在不同剂量和不同时间腓肠肌收缩张力的变化，目的在于揭示BoNT-A对骨骼肌作用模式，为深入研究肉毒毒素其他血清型对骨骼肌的作用，化学性拮抗肉毒毒素药物在阻止神经芽生和突触前膜修复试验提供模型。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：蟾蜍（兰州大学实验动物中心，60～90 g）。BoNT-A （兰州生物制品研究所）用RGS分别稀释成0.75～5.0 U/0.2 mL。SC用RGS稀释成0.04 mg/0.2 mL。仪器：肌肉张力换能器 （北京航天医学工程，型号：JH-2），生物机能实验系统（泰盟科技有限公司，型号：BL-420）。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 动物随机分为两组：琥珀胆碱组（SC，n = 44）和BoNT-A组（n = 42）。SC组蟾蜍右侧腓肠肌注SC 0.04 mg/0.2 mL，左侧肌注0.2 mL RGS作为对照；BoNT-A组右侧腓肠肌分别注射0.75、1.25、2.5、5.0 U BoNT-A，左侧肌注0.2 mL RGS作为对照。

1.2.2 腓肠肌单收缩模型 分别将注射RGS、SC和BoONT-A后的蟾蜍于1、4、7、10、24、48 h带有坐骨神经-腓肠肌的股骨分离，制备坐骨神经-腓肠肌模型标本并置入RGS 10～20 min，随后固定在张力换能器和肌动器（张力传感器在上，肌动器在下）上，刺激电极置于坐骨神经，腓肠肌跟腱的结扎线固定在肌肉张力换能器的弹簧片上。张力换能信号输出BL-420生物功能实验系统。测定单发电刺激（0.5 Hz，2 V）坐骨神经所引发的腓肠肌收缩。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 10.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BoNT-A时间依赖性抑制腓肠肌但收缩

SC注射腓肠肌后1 h单发电刺激坐骨神经引起的腓肠肌单收缩肌张力显著低于对照组[（21.05±1.5）g比（48.92±4.51）g，P < 0.01），而第4～48小时肌肉单收缩肌张力恢复正常，与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

1.25 U BoNT-A注射腓肠肌后，电刺激坐骨神经腓肠肌单收缩肌张力1 h[（31.25±3.69）g]，4 h[（33.87±4.10）g]，7 h[（30.51±2.99）g]， 10 h[（14.01±0.98）g]， 24 h [（14.03±0.79）g]和48 h[（14.12±0.85）g]均低于对照组[（46.32±1.12）g]，其中第1～7小时单收缩肌张力与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），而10～48 h收缩张力持续降低，与对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），与1～7 h比较差异也存在统计学意义（P < 0.05），表明BoNT-A对电刺激坐骨神经引发的腓肠肌收缩有明显的抑制作用，特征为随着时间的延长抑制逐渐增强。见图2。

2.2 BoNT-A各剂量对腓肠肌单收缩抑制作用

0.75 U BoNT-A不能改变电刺激坐骨神经引起腓肠肌收缩张力（P > 0.05）；而1.25～5.0 U BoNT-A抑制腓肠肌单收缩张力，其中1～7 h收缩肌张力低于对照组（P < 0.05），10～48 h肌张力更低（P < 0.01），10～48 h与1～7 h比较差异有统计学意义（P < 0.05）。但1.25 U，与2.5和5.0 U剂量相比其作用在各时间段差异无统计学意义（P > 0.05），提示BoNT-A一旦达到阈剂量（1.25 U）后抑制作用不会随着剂量的增加而继续增强。见表1。

3 讨论

蟾蜍右侧腓肠肌内注射BoNT-A 1.25 U后1～48 h显著抑制电刺激坐骨神经引起的腓肠肌收缩，该作用10～48 h最为更明显，提示BoNT-A对骨骼肌的收缩力有抑制作用，其特征为随着时间的延长，其作用加强。其机制可能是BoNT-A渗透过程缓慢，1～7 h仅渗透到一部分肌束，导致部分肌束被抑制，而10 h时可渗透其余肌束，作用达到高峰且出现非常显著的收缩力抑制。当BoNT-A在10 h作用达到高峰后，24～48 h作用无明显差异，提示其对骨骼肌的抑制作用持续期长。

BoNT-A剂量0.75～5.0 U肌肉注射，0.75 U剂量不影响骨骼肌单收缩张力，而1.25～5.0 U均抑制骨骼肌的单收缩肌张力，各时间段的肌肉收缩张力均低于对照组，其中，1～7 h肌张力低于对照组（P < 0.05），而10～48 h肌张力比对照组更加降低（P < 0.01），10～48 h收缩张力比1～7 h明显低，两者相比差异有统计学意义（P < 0.05），说明随时间延长BoNT-A对骨骼肌收缩张力的抑制作用更强，进一步证明其骨骼肌的抑制作用存在时效关系，但1.25、2.5和5.0 U对骨骼肌的抑制作用各剂量在各时间段比较差异无统计学意义（P > 0.05），表明1.25 U BoNT-A为最有效作用剂量，提示该剂量作用突触前膜裂解SNAP-25达高峰，后续剂量增加并不引起对骨骼肌的单收缩抑制的增强。

SC作用于运动终板膜（突触后膜）上的N2受体，促终板膜和附近肌细胞膜去极化而形成不应期状态，阻滞神经-肌肉化学传递，导致肌肉松弛，其特点为肌松作用显现快速，但作用时间短。师养荣等[9]以大鼠为研究对象，观察不同剂量的SC对肌梭传入放电的影响，SC 0.3～6.0 mg/kg静脉滴注，结果0.3 mg/kg的剂量即可达到阈剂量。本研究发现0.04 mg/0.2 mL剂量的SC注射蟾蜍腓肠肌可抑制电刺激引起的骨骼肌收缩1 h，但随后其作用消失。

BoNT-A虽然也作用于神经肌肉接点，但其作用点位于突触前膜，形成亲和、内转、特异性结合，切割具有释放神经递质功能的神经突触相关蛋白SNAP_25，使神经递质囊泡的胞吐不能发生，阻滞ACh释放，产生肌肉麻痹，特点为持续增强并维持时间长。本研究发现肌注BoNT-A后从第1小时起发挥抑制作用，10 h达到高峰，延续48 h。说明BoNT-A对骨骼肌单收缩张力的抑制作用在一定时间内存在正相关的时效关系。

[参考文献]

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[2] Cordivari C， Misra VP， Catania S. New therapeutic indications for butulinum toxins [J]. Mov Disord，2004，19（Suppl8）：157-162.

[3] Schiavo G， Matteoli M， Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis [J]. Physiol Rev，2000，80（2）：717-720.

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[5] Lebeda FJ， Olson MA. Secondary structural predictions for the clostridial neurotoxins [J]. Proteins，1994，20：293-300.

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[8] Goonetilleke A， Harris JB. Clostridial neurotoxins [J]. J Neu Neur Psych，2004，75：35-39.

[9] 师养荣，樊小力，秦潮.琥珀胆碱引起肌梭传入放电增加的时效关系[J].西安医科大学学报，1996，17（2）：143-146.

（收稿日期：2013-07-17 本文编辑：卫 轲）