VEGF与MUC1基因在甲状腺癌中的表达及意义

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摘 要 目的：探讨转移血管内皮生长因子与多态性上皮黏蛋白1(MUC1)基因在甲状腺中的表达及临床意义。方法：采用定量RT2PCR与图像扫描定量分析技术和免疫组化方法(SABC法)检测,分别检测64例甲状腺癌中MUC1基因和vegf的表达水平。结果：muc1基因在甲状腺癌中表达率73.43%(47/64)；MUC1在无淋巴结转移组中的检出率69.44%(25/36)；在淋巴结转移组中的检出率78.57%(22/28)，P＞0.05)，VEGF在甲状腺癌中表达率78.12%(50/64)。结论：检测MUC1基因与VEGF的表达水平可能有助于判断甲状腺癌是否转移；血管内皮生长因子与MUC1的高表达可能在甲状腺癌转移过程中具有内在联系。

关键词 甲状腺癌 血管内皮生长因子 多态性上皮黏蛋白1

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.02.253

资料与方法

2009～2010年收治甲状腺癌患者64例，男27例，女37例，平均年龄32.15岁；其中状癌30例，滤泡状癌9例，髓样癌11例，未分化癌18例。MUC1质粒由赤峰学院医学院病理学教研室提供。反转录酶及Taq酶，dNTPs。DOC21000型图像扫描定量分析系统。MUC1引物的设计MUC1引物运用软件进行设计。MUC1上游引物CGTCA TGGA2CA TTGA TGGTACC，下游引物GGTACCTC2CTC TCACCTCCTCCAA，扩增片段长度228bp；对照β2action 为CACTGTGTTGGCGTACA GGT与TCA TCACCA TTGCAA TGAG，扩增长度154bp。抗体及兔抗人VEGF抗体、SABC试剂盒。

实验具体步骤：①RNA的提取：将组织剪碎后按异硫氰酸呱一步法提取总RNA并扫描定量。②mRNA反转录：10×RT buffer 2μl，10mmol/L dNTP 2μl，随机引物2μl，RNasin 1μl(20U/μl)，无RNase水10μl，总RNA模板2μl(0.2μg/μl)混匀后，离心8秒，采用65℃ 5分钟，37℃ 60分钟，75℃ 5分钟，小鼠白血病病毒反转录酶(MMLV)在37℃ 10分钟时加入。③PCR扩增：取反转录产物2μl作模板，依次加入dH2O 21μl，10×PCR buffer 3μl，2.5mmol/L dNTP 3μl，上下游引物与β-actin引物各取1μl，Taq 酶1.5U，混匀后，离心8秒，加入30μl石蜡油，采用94℃ 35秒，55℃ 55秒，72℃ 1分钟，35个循环，最后在72℃延伸7分钟。④结果判断：每次PCR扩增皆设立阳性、阴性对照，各取产物15μl进行10g/L琼脂糖凝胶电泳20分钟，EB染色，用DOC-1000型图像扫描定量分析系统对电泳分离出的片段进行扫描，获取相对A值，产物A值/β-actin值比值＞1为高表达，＜1为低表达，=0为未检出表达；以比值＞0为阳性，=0为阴性。比值作为定量结果。

VEGF实验方法：①免疫组化染色主要步骤：采用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法，操作按试剂盒说明书进行。主要包括切片脱蜡至水，微波抗原修复，山羊血清封闭，分别依次滴加VEGF抗体过夜(工作浓度1:100)，生物素化二抗及ABC复合物，DAB显色，苏木素复染后封片。用PBS代替一抗平行操作染色做阴性对照，用已知乳腺癌阳性片做阳性对照。②染色结果判定标准：在组织切片中显示胞浆或胞核染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志，参考Kawasaki等报道的方法计算各指标表达程度[1]。计数5个高倍视野，将平均阳性细胞数分为5类：0-阳性细胞≤1%，1-阳性细胞1%～25%，2-阳性细胞25%～50%，3-阳性细胞50%～75%，4-阳性细胞≥75%。根据染色程度将阳性信号分为3类：染色强度弱(1+)-淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色，染色强度强(3+)-呈棕黄至棕褐色染色，中等染色强度(2+)-染色强度介于弱阳性与强阳性之间，染色强度×阳性细胞百分数为每例组织染色的综合记分。综合记分≥1判为表达阳性，＜1则为阴性。

统计学处理：运用X.2检验进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

VEGF与MUC1表达在甲状腺癌中的关系：VEGF与MUC1相关性分析采用spearman等级相关分析呈正相关(r=0.8869)。见表1。

讨 论

研究显示，VEGF在各型甲状腺癌中过度表达，并与肿瘤组织分化和恶性进展密切相关，进一步验证了VEGF对甲状腺癌发病的重要意义。

进一步研究表明，MUC1基因的编码产物是十分重要的甲状腺癌标志物，用RT2PCR检测甲状腺状癌及甲状腺良性病变组织中MUC1阳性表达，研究结果表明，RT2PCR检测MUC1表达可作为甲状腺癌术前细针穿刺分子生物学诊断的依据。本组MUC1基因在甲状腺癌中表达率73.43%；在无淋巴结转移组中的检出率69.44%；在淋巴结转移组中的检出率78.57%，VEGF在甲状腺癌中表达率78.12%。

总之，联合检测甲状腺癌组织中VEGF与MUC1的表达情况有助于对甲状腺癌患者的生物学行为进行正确的评价，可作为判断甲状腺癌恶性程度的指标，并指导临床治疗，为开发新的抗肿瘤药物和寻找新的基因治疗的靶基因提供线索和思路。

参考文献

1 Klein M,Picard E,Vignand JM.Vascular endothelialgrow th factor(VEGF) gene and protein:stro ng ex pr ession in thyro iditis and thy roid carcinoma.J Endocr inol,1999,161:41-49.