氢醌对L-02肝细胞损伤的研究

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摘要： ［目的］ 探讨氢醌（HQ）对l-02肝细胞损伤及其可能的作用机制。 ［方法］ 应用噻唑蓝（MTT）比色法检测浓度分别为0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L的HQ作用24 h后对L-02肝细胞存活率的影响；利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒之后L-02肝细胞的形态学改变并摄影成像；利用全自动生化分析仪检测不同浓度HQ染毒24 h后L-02肝细胞的乳酸脱氢酶（LDH）漏出率和丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，以观察HQ对L-02肝细胞膜完整性的影响。 ［结果］ 在0～80 μmol/L浓度的范围内染毒24 h后，HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响（P > 0.05）；浓度≥160 μmol/L时，染毒24 h后，存活率则明显下降（P < 0.01），LDH漏出率、ALT和AST活性均有随着HQ浓度的增加而升高的趋势；160和320 μmol/L组LDH漏出率与对照组比较有明显升高（P < 0.01）。但ALT和AST活性只在320 μmol/L组与对照组比较才有明显增加（P < 0.01）。此外，160和320 μmol/L组L-02肝细胞的形态与对照组相比发生了明显的改变。 ［结论］HQ可能是通过损伤细胞膜而对L-02肝细胞产生毒性影响。

关键词：氢醌；L-02肝细胞；细胞毒性

A Study of the Damage of Hydroquinone on L-02 Hepatic Cells HU Gong-hua1，3，ZHUANG Zhi-xiong2*，YANG Ling-qing2，SHA Yan3，YANG Jian-ping3（1.Department of Preventive Medicine，Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China；2.Shenzhen Center for Disease Dontrol and Prevention，Shenzhen 518020，China；3.Department of Preventive Medicine，School of Public Health，SUN YAT-SEN University，Guangzhou 510080，China）

Abstract： ［Objective］ To characterize the genereal toxic effects of hydroquinone（HQ）to L-02 hepatic cells and its possible mechanism.［Methods］ MTT assay was conducted to detect the effects of HQ in various concentrations（0，5，10，20，40，80，160，and 320 μmol/L）for 24 hrs on the viability of L-02 hepatic cells. Morphological change of such treated L-02 hepatic cells was also observed by versatile inverted microscope and captured. Finally，the leakage rate of LDH and the activities of ALT and AST in the cultured medium of hepatic L-02 cells treated with HQ were measured by Automatic Biochemistry Analyser. ［Results］ MTT assay showed that the survival rate of L-02 had little effect from the treatment with HQ in the concentration from 0 to 80 μmol/L（P > 0.05），whereas the survival rate in the groups of 160 μmol/L and 320 μmol/L after treated with HQ for 24 hours was significantly lower than that in the control（P < 0.01）. The LDH leakage rates and the activities of ALT and AST were enhanced with the increase of HQ concentration，and the LDH leakage rates were significiantly increased in the groups induced by 160 μmol/L and 320 μmol/L HQ comapred to the control（P < 0.01）. The activities of ALT and AST were boosted significantly in 320 μmol/L group（P < 0.01）. Besides，marked morphological change of L-02 hepatic cells treated with HQ（160 μmol/L and 320 μmol/L）for 24 h was observed. ［Conclusion］ HQ could induce toxic effect to L-02 hepatic cells by impairing cellular membrane.

Key Words：hydroquinone；L-02 hepatic cell；cell toxicity

氢醌（hydroquinone，HQ）又名对苯二酚，是一种用途广泛的有机化工原料，如用作还原剂、抗氧化剂、聚合抑制剂、黑白照像术的显影剂以及化妆品添加剂和皮肤病治疗制剂等；也是苯在生物体内的重要中间代谢产物。动物实验表明，长期接触HQ可造成肝、肾损害［1］，产生骨髓和血液毒性［2］，并导致肿瘤的形成［3］。对职业人群调查结果也显示，HQ对皮肤和眼具有刺激作用［4］。但是，体内研究易受众多因素的影响。细胞培养作为一种体外研究手段，具有灵敏度高、参差性小和再现性好等优点，现已被越来越多地应用。然而，目前体外试验往往局限于HQ的骨髓及外周血淋巴细胞毒性，对其他细胞的作用则研究较少；并且有关HQ对人L-02肝细胞毒性影响的研究未见报道。为此，本项目通过MTT实验，对细胞形态学改变的观察，细胞LDH漏出率、ALT和AST活性测定等方法以期研究HQ对L-02肝细胞的损伤作用。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（美国AMRESCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素和链霉素（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），二甲基甲酰胺（DMF，Genview分装），十二烷基磺酸钠（SDS，美国Sigma公司），丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）等试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 HFsafe-1200型生物安全柜、HF212uv型CO2恒温培养箱（均为上海力申科学仪器公司），XDS-1B型倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂），TDL-5-A型低速离心机（上海安亭科学仪器厂），BP1211S型电子天平（德国赛多利斯有限公司），Milli-Q Biocel型超纯水系统装置（法国MILIPORE公司），HVE-50高压灭菌器（日本HIRAYAMA公司），SUT-6120热空气消毒箱（德国Heraeus公司），MM-I型微量振荡器（上海精科实业有限公司），Powerwavex型酶标仪（美国BIO-TEK公司），KS400型光学图像分析仪（德国ZEISS公司），VCX400型超声细胞破碎机（美国SONICS公司），7080型全自动生化分析仪（日本HITACHI公司）。

1.1.3 细胞及受试物 L-02肝细胞（购自中国科学院上海细胞生物学研究所），HQ（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养基采用含10％胎牛血清的RPMI-1640，并加入青霉素（100×103 U/L）和链霉素（100 mg/L）。将L-02肝细胞用37 ℃、体积分数为5％的CO2细胞培养箱培养。每3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞存活率检测 将处于对数生长期的L-02肝细胞用0.25%胰酶消化，接着用吸管吹打使之成单细胞悬液并调整细胞浓度为105个/L，接种于96孔培养板中，置37 ℃、5％的CO2培养箱中培养，待细胞80％融合时，弃原培养液，加入含不同浓度HQ的培养液200 μl并使其终浓度分别为0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L，另设培养液对照组（即调零孔），每种浓度设9个平行孔；24 h之后弃去旧培养液，每孔加入100 μl新鲜培养液及20 μl的MTT液（5 g/L）。2 h后，倾去培养液，每孔加入150 μl的细胞裂解缓冲液（50%DMF+20%SDS，pH4.6），室温下于微量振荡器上振荡10 min，使所形成的紫色结晶充分溶解。然后用酶标仪测定各孔的吸光度D值（参考波长为630 nm，实验波长为570 nm）。按下式计算存活率：细胞存活率（%）=处理组吸光度均值/对照组吸光度均值×100%。

1.2.3 细胞内、外LDH活性和ALT、AST活性检测 将处于对数生长期的L-02肝细胞用不同浓度HQ染毒，24 h之后收集5 ml培养液于离心管中，4 ℃条件下1 000×g离心5 min；收集上清液于4 ℃保存，以备测定细胞外LDH活性和ALT、AST活性；接着将所剩余的细胞置-20 ℃冰箱内约1.5 h，取出置20 ℃的水浴中融化约1 h，反复冻融3次；然后用吸管将未胀破的细胞用吸管吹打数次，使之成悬液，并转移至离心管中；接着用超声细胞破碎机将细胞裂解完全；最后于4 ℃条件下1 000×g离心5 min；取上清液4 ℃保存，以备测定细胞内的LDH活性之用。取样品各300 μl于日立7080型全自动生化分析仪上检测细胞内、外LDH活性［5，6］和 ALT、AST活性［7］。具体操作按试剂盒说明。LDH漏出率（%）=胞外LDH活性/（胞外LDH活性+胞内LDH活性）×100%。

1.2.4 细胞形态学观察 利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒24 h后L-02肝细胞的形态学改变并摄影成像。

1.2.5 统计学分析 细胞存活率、LDH漏出率和ALT、AST活性的测定值都以（均值±标准差）表示。实验数据使用SPSS11.0统计软件进行ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度HQ对L-02肝细胞存活率的影响

在HQ 0～80 μmol/L浓度的范围内，各浓度组肝细胞的存活率与对照组（即0 μmol/L组）之间没有明显的差异（P > 0.05）；当浓度≥160 μmol/L时，肝细胞存活率与对照组相比有明显降低（P < 0.01），结果见表1。

2.2 HQ对L-02肝细胞的LDH漏出率及ALT、AST活性的影响

如表1所示，HQ染毒24 h之后，L-02肝细胞内的LDH漏出率有随着HQ浓度的增加而升高的趋势；高浓度组（≥160 μmol/L）L-02肝细胞内LDH漏出率与对照组比较有明显的升高（P < 0.01）。细胞培养液中ALT和AST活性也有随着HQ浓度增加而升高的趋势，但只在320 μmol/L组与对照组比较才有明显差异（P < 0.01），其他各处理组与对照组之间无明显差异（P > 0.05）。

2.3 不同浓度HQ作用后L-02肝细胞的形态学观察

于倒置显微镜下观察各浓度组细胞的形态。对照组L-02肝细胞呈多边形，单层排列，无重叠生长，有光泽，大小均一，黑颗粒少，细胞界限清晰；低浓度组（5、10、20、40和80 μmol/L组）与对照组（0 μmol/L）相比，细胞形态无明显差异；而高浓度组（160和320 μmol/L组）细胞的形态却明显异常，如细胞透光度降低或无光泽、细胞浓缩、形态不规则、细胞间隙增大、界限模糊、黑颗粒增多、许多细胞贴壁能力下降而呈漂浮状态、细胞死亡数明显增多等，如图1所示。

3 讨论

研究外来化学物对体外培养细胞的毒性作用，是进一步探讨其各种生物学效应的基础；对细胞毒性可从细胞形态、细胞生长情况及其生化指标的改变来评价。细胞形态可通过细胞的外形、光泽、细胞空泡的积累、细胞核及细胞质的改变和细胞的贴壁及脱壁等指标来反映；细胞的生长情况及活细胞数量的多少可通过MTT试验测定细胞的相对存活率来反映；而LDH漏出率、ALT、AST活性等生化指标则可反映细胞膜的完整性或通透性。

本实验采用MTT比色法测定了HQ对L-02肝细胞存活率的影响。结果显示，在一定的浓度范围内，HQ对L-02肝细胞相对存活率的影响存在着一定的剂量依赖性。在24 h染毒后，低浓度组（5～80 μmol/L）HQ作用于L-02肝细胞，细胞存活率虽然略有降低的趋势，但与正常（对照）组相比没有统计学差异。当染毒浓度≥160 μmol/L时，HQ就会对L-02肝细胞产生明显的毒性作用而对细胞存活率和细胞形态产生影响。

正常情况下，细胞内各种酶是不可能通过质膜而漏出于胞外的，只有当肝细胞受到损伤时细胞膜通透性增强，LDH、ALT和AST便会从细胞质内漏出，细胞质内LDH、ALT和AST减少，培养液中LDH、ALT和AST增多，因此测定培养液中LDH活性或LDH漏出率和ALT、AST活性可以间接反映出细胞膜的损害情况，从而间接反映外源性化学物的细胞毒性。LDH漏出率测定结果显示：在0～80 μmol/L浓度范围内的HQ对L-02肝细胞的LDH漏出率没有影响（P > 0.05），说明该浓度范围内的HQ对肝细胞没有明显毒性作用；当HQ浓度达到160 μmol/L时，漏出率则有明显的增加；160和320 μmol/L的HQ染毒组与正常（对照）组相比，其LDH漏出率有显著增加（P < 0.01）。同时，ALT和AST活性也随着HQ染毒浓度的增加而升高，其中320 μmol/L组的ALT和AST活性与对照组比较差异有显著性（P < 0.01），表明当HQ的浓度超出一定范围时就会破坏L-02肝细胞膜的完整性，导致细胞膜的渗透性增强，并最终导致L-02肝细胞的明显死亡。这些结果与MTT实验结果基本一致，达到了相互验证的目的，并且多角度地保证了实验结果的重复性和可靠性，从而为进一步的研究奠定了可靠的基础。

根据本实验结果并结合已有的研究资料［8，9］，可以认为HQ对L-02肝细胞的毒性作用机制可能是：HQ通过一系列的氧化还原反应而产生许多种活性氧类，如自由基和H2O2等；而这些物质可引起生物膜的脂质过氧化，导致细胞膜的通透性升高，甚至引起细胞膜结构的崩塌和破坏，从而最终导致L-02肝细胞死亡率的明显升高。其具体的作用机制还有待于进一步深入研究。

参考文献：

KARI F W，BUCHER J，EUSTIS S L，et al. Toxicity and carcinogenicity of hydroquinone in F344/N rats and B6C3F1 mice［J］. Food Chem Toxicol，1992，30（9）：737-747.

DECAPRIO A P. The toxicology of hydroquinone-relevance to occupational and environmental exposure［J］. Cril Rev Toxicol，1999，29（3）：283-230.

SHIBATA M A，HIROSE M，TANAKA H，et al. Induction of cell tumors in rats and mice，and enhancement of hepatocellular tumor development in mice after long-term hydroquinone treatment［J］. Jpn J Cancer Res，1991，82（11）：1211-1219.

吴向东，龚梓初.氢醌对皮肤和眼刺激作用的实验研究［J］.职业卫生与应急救援，1997，15（2）：63-66.

曾桂凤，刘建勋，李澎，等. 丹参三七不同配比对缺氧复氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护保护作用［J］. 精细化工，2006，23（2）：126-129.

林蓉，刘俊田，李旭，等. 川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用［J］. 中国药理学与毒理学杂志，2000，14（6）：425-429.

郭晓英，孙迎春，孙贵范. 氟化物对原代培养大鼠肝细胞酶活力及超微结构的影响［J］. 卫生研究，2005，34（1）：35-37.

DO CEU SILVA M，GASPAR J，DUARTE SILVA I，et al. Mechanisms of induction of chromosomal aberrations by hydroquinone in V79 cells［J］. Mutagenesis，2003，18（6）：491-496.

ZHANG L，ROBERRSON M L，KOLACHANA P，et al. Benzene metabolite，1，2，4-benzenetriol，induces micronuclei and oxidative DNA damage in human lymphocytes and HL60 cells［J］. Enviro Mol Mutagen，1993，21（4）：339-348.

（收稿日期：2006-07-31）

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