人参皂苷化学修饰物PM1诱导肝癌HepG2细胞凋亡
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[摘要] 目的：探讨人参皂苷化学修饰物pm1体外诱导肝癌hepg2细胞凋亡作用。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）还原法检测不同浓度的人参皂苷化学修饰物PM1对肝癌HepG2细胞增殖的作用；流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡周期及细胞凋亡率。结果：PM1抑制肝癌HepG2细胞生长，呈浓度依赖关系。用50和100 mg/L PM1处理细胞24 h后，PM1诱导了细胞凋亡和调节细胞周期，凋亡率与对照组比较明显升高（P
[关键词] 人参皂苷化学修饰物；肝癌；细胞凋亡
[中图分类号] R735.7[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）01（c）-021-02
Apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells induced by ginsenoside modifier PM1
YANG Chun-guang, GONG Xiao-jie, SUN Chang-bin
(Medical College of Dalian University, Dalian116622, China)
[Abstract] Objective: To study the effect of PM1 on inducing apoptosis of HepG2 cells in vitro. Methods: The HepG2 cells were treated with different doses of PM1. Cell proliferation was measured by MTT assay. Cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry. Results: PM1 inhibited proliferation of HepG2 cells in concentration-dependent manner. FCM assay showed that PM1 regulated cell cycle and induced apoptosis of HepG2 cells after treated with 50 and 100 mg/L PM1 for 24 h. The apoptosis rates were increased (P
[Key words] Ginsenoside modifier; Hepatocellular carcinoma; Apoptosis
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）作为传统中药，具有广泛的药理作用。人参中主要活性成分为人参皂苷，目前已从人参中分离并鉴定了50多种人参皂苷。人参皂苷有增强胆固醇代谢、刺激血清蛋白合成、免疫调节和抗感染等各种生物活性，尤以抗肿瘤活性更为国内外学者所重视。最近，我们通过模拟人参皂苷体内代谢的全过程，采用酶降解及化学合成技术得到了与人参皂苷体内代谢一致的产物PM1[20(S)原人参二醇-20-O-β-D-葡萄糖基-6-O-棕榈酰吡喃糖苷]，初步的药理学实验发现其具有抗肿瘤活性，但其抗肿瘤机制还不十分清楚[1]。本实验以肝癌HepG2细胞为工作模型，观察PM1抑制肿瘤细胞生长的作用，探讨其抗肿瘤作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株与试剂
PM1由实验合成，纯度>95%，用时以PBS稀释；人肝癌HepG2细胞购于中国科学院上海细胞库；DMEM培养基为美国Invitrogen公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品。
1.2 主要仪器
酶标仪（ELX800, BD-TEK）、流式细胞仪（Becton Dickinson Mountain View VA）和EM-1200EX型透射电镜（日本电子公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养HepG2细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2的湿化培养箱中培养。
1.3.2 MTT法检测细胞增殖活性取对数生长期细胞，分为4组，接种于96孔培养板，药物浓度分别为25、50和100 mg/L，同时设对照组，每孔100 μl培养液，含5×103个细胞。孵育24 h后每孔加MTT 20 μl ，37℃孵育4 h，弃培养液，每孔加入DMSO溶液150 μl，震荡10 min，酶标仪（波长490 nm）测定吸光度（A），每组设4个平行孔，独立重复3次。抑制率（%）=[（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%]。抑制率≥30%为细胞对该药敏感。
1.3.3 细胞周期及细胞凋亡测定将传代培养的HepG2细胞接种于培养瓶中，每瓶含细胞1×106个，24 h后加药，PM1终浓度为50和100 mg/L，对照组加等体积的PBS。胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤。将肿瘤细胞悬液0.5 ml注入70%冷乙醇中固定24 h。RNase消化后，加入1.5 ml PI（50 mg/L）处理。上流式细胞仪分析细胞周期的分布和检测凋亡率。
1.4 统计学方法
数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，均数间的比较用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 PM1对细胞增殖活性的影响
经PM1处理后的肝癌HepG2细胞生长明显受到抑制，与对照组比较差异有显著性（P
2.2 PM1对细胞周期和细胞凋亡率的影响
流式细胞仪检测表明，肝癌HepG2细胞经50 mg和100 mg/L的PM1作用24 h后，S期和G2/M期的细胞比率增加，G0/G1的细胞比率下降。细胞凋亡率分别从对照组的（1.06±0.19）%升高到（9.80±1.23）%和（20.68±3.26）%（表2）。
3 讨论
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，凋亡异常与肿瘤的发生和发展有着极为密切的关系。细胞凋亡率下降是肿瘤的特征变化之一，细胞增殖和细胞凋亡之间的不平衡将导致肿瘤的发生。细胞增殖与凋亡失败决定肿瘤生长的速度，其中比较重要的因素就是细胞周期的调控细胞被阻止在G1/S期[2]。
人参皂苷是人参中的主要有效成分，已显示出较好的抗肿瘤活性，但人参皂苷抑瘤机制至今仍不完全清楚。药代动力学研究表明，人参皂苷肠内菌代谢物是人参皂苷发挥功效的真正有效成分，这些肠内菌代谢物又被肝脏进一步代谢成新的脂肪酸酯类化合物EM1，EM1显示出更强的抗肿瘤活性[3]。EM1是一种混合物，通过质谱分析发现其包括硬脂酸M1酯、棕榈酸M1酯和油酸M1酯。我们通过化学合成获得其中一个单体化合物PM1，初步观察其具有抗肿瘤活性，但机制还不清楚。
本实验结果表明，PM1对肝癌HepG2细胞生长有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。50和100 mg/L的PM1作用于HepG2细胞24 h后，可诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测表明，细胞分布周期发生变化，细胞主要被阻滞在S期和G2/M期，癌细胞的增殖生长速度减慢。正常细胞增殖须经过G1、S、G2、M期这一细胞周期，S期为DNA合成期，G2期为DNA合成后期，M期为有丝分裂期。PM1抑制了肿瘤细胞的DNA合成及有丝分裂，将其阻滞于S期和G2/M期，从而导致肝癌HepG2细胞增殖减慢或停止，且呈剂量依赖性。
综上所述，PM1是一个有效的抑制肿瘤生长的人参皂苷化学修饰物，其抑制肿瘤细胞生长可能与阻滞肿瘤细胞进入分裂期有关，但其诱导肿瘤细胞凋亡的机制还需要进一步探讨。
[参考文献]
[1] 弓晓杰,陈丽荣.人参皂苷化学修饰物PM1抗肿瘤活性的研究[J].大连大学学报,2006,27(6):84-86.
[2] Cheng CC, Yang SM, Huang CY, et al. Molecular mechanisms of ginsenoside Rh2-mediated G1 growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells [J]. Cancer Chemother Pharmacol,2005,55(6):531-540.
[3] Hasegawa H. Proof of the mysterious efficacy of ginseng: basic and clinical trials: metabolic activation of ginsenoside: deglycosylation by intestinal bacteria and esterification with fatty acid [J]. J Pharmacol Sci,2004,95(2):153-157.
（收稿日期：2008-07-21）