HPLC法测定甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质
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[摘要] 目的：建立测定甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的高效液相色谱法。方法：采用ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（用磷酸溶液调节pH至3.0）-甲醇（90∶10）为流动相，流速1.0 ml/min，于225 nm波长处测定。结果：在本色谱条件下，2种有关物质均能得到较好的分离，且在测定范围内有较好的线性及精密度。结论：采用hplc法测定甘氨酰-l-谷氨酰胺有关物质的方法简便、准确、灵敏度高，方法可靠，可用于甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的测定。
[关键词] 甘氨酰-L-谷氨酰胺；有关物质；高效液相色谱法
[中图分类号]R917 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）04（b）-042-02
Determination of two related substances in glycyl-L-glutamine by HPLC
LIU Wen-ping
[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for determination of two related substances in glycyl-L-glutamine. Methods: The separation was performed with a C18 ODS column (4.6 mm×250 mm, 5μm) ; the mobile phase consisted of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate (adjust pH value to 3.0 with phosphoric acid)-methanol(90∶10); the flow rate was 1.0 ml/min; the detection wavelength was set at 225 nm.Results: In this chromatography system, two related substances had a good separation and a good linear relationship over the determination concentrations. Conclusion: This method is simple,accurate,sensitive and applicable for related substances determination of glycyl-L-glutamine.
[Key words] Glycyl-L-glutamine; Related substances; HPLC
甘氨酰-L-谷氨酰胺为二肽类氨基酸类，是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中的主要成分之一。它作为体内的氮源运载工具，在组织与小肠细胞、结肠细胞淋巴细胞及再生细胞间穿梭，一方面清除氨等代谢废物，另一方面为蛋白质和DNA的合成提供氮源，主要用于创伤、败血症和某些器官衰竭危重患者。因本品是以L-酪氨酸为原料，经系列反应制得甘氨酰-L-谷氨酰胺。样品中杂质可能来源于原料、中间体、降解产物及生产过程中，根据对合成中相关杂质进行定性，发现产品中主要杂质为焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）。参考化学药物的杂质检查要求[1]，且鉴于高效液相色谱法有较高的灵敏度、专属性强、易于量化的优点，我们决定采用高效液相色谱法[2]对本品的有关物质进行测定研究，参考文献[3]中液相条件，经过数次试验筛选，最终确立了色谱条件，并进行了方法学验证。
1 仪器与试药
LC-2130泵，LC-2050高效液相色谱仪，LC-2030紫外检测器（上海天美科学仪器有限公司）；磷酸二氢钠，磷酸均为分析纯；甘氨酰-L-谷氨酰胺对照品（批号：060201，自制）；甘氨酰-L-谷氨酰胺样品（批号：060213，自制）；环（甘氨酰-L-酪氨酸）对照品（批号：060210，自制）；焦谷氨酸对照品（批号：060215，自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.05 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（用磷酸溶液调节pH至3.0）-甲醇（90∶10）；流速为1.0 ml/min，检测波长为225 nm；柱温为室温；进样量为20 μl，用外标法进行定量。在本色谱条件下，甘氨酰-L-谷氨酰胺与环（甘氨酰-L-酪氨酸）及焦谷氨酸均得到较好分离。结果见色谱图1。
图1 HPLC色谱图
[1：环（甘氨酰-L-酪氨酸），2：甘氨酰-L-谷氨酰胺，3：焦谷氨酸]
2.2 有关物质峰位的确定
分别取焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）、甘氨酰-L-谷氨酰胺对照品适量，加水溶解并稀释成一定浓度的对照品溶液，分别精密量取20 μl进样，记录色谱图，结果环（甘氨酰-L-酪氨酸）、甘氨酰-L-谷氨酰胺、焦谷氨酸的保留时间分别为4.0，6.7，14.5 min。
2.3 色谱条件适用性试验
取本品适量，分别进行以下操作：
2.3.1光破坏试验取本品适量，置表面皿中铺成≤5 mm厚的薄层，于4 500 lx强光下照射2 d。称取本品适量，加水制成每1毫升含10 mg的溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μl进样。
2.3.2 热破坏取本品适量，加水制成每1毫升约含10 mg的溶液，置于100℃水浴加热破坏3 h。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μl进样。
2.3.3 酸破坏取本品约10 mg，加1 mol/L的盐酸溶液5 ml，置于100℃水浴中加热30 min，放冷，用1 mol/L氢氧化钠溶液中和后，转移至50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μl进样。
2.3.4 碱破坏 取本品约10 mg，加1 mol/L的氢氧化钠溶液5 ml，置于100℃水浴中加热45 min，放冷，用1 mol/L盐酸溶液中和后，转移至50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μl进样。
2.3.5 氧化破坏取本品约10 mg，加入30%过氧化氢溶液1 ml，室温放置3 h，转移至50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μl进样。结果，上述操作方法中有关物质含量显著增加，且降解产物均与甘氨酰-L-谷氨酰胺主峰获得良好分离，表明本色谱条件适于本品的有关物质测定。
2.4 线性关系考察
精密称取焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）对照品约25 mg，置10 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml至100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取该溶液1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 ml分别置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得系列标准溶液。精密量取该系列标准溶液20 μl分别注入色谱仪，记录色谱图。以峰面积Y对溶液浓度X进行线性回归，得焦谷氨酸的回归方程为：Y=6 018.4X+1 218.3，r=0.999 2；线性范围为2.539~20.312 μg/ml。环（甘氨酰-L-酪氨酸）的回归方程为：Y=4 573.5X-1 482.7，r=0.999 6；线性范围为5.134~25.670 μg/ml。结果表明，两种物质在各自的浓度范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
取“2.4”项下方法配制两种有关物质的3号溶液，分别取20 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次，测定各有关物质的峰面积，计算焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）的RSD值分别为0.70%，0.67%。
2.6 定量限和最低检出限
配制不同浓度的2种已知杂质的对照品溶液，分别取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。当主成分峰高为噪音峰高的10倍时，焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）的定量限为0.8，0.7 ng；当主成分峰高为噪音峰高的3倍时，焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）的最低检出限为0.3，0.2 ng。
2.7 回收率试验
精密称取样品25 mg，分别称取6份，分别置100 ml量瓶中，分别精密加入“2.4”项下方法配制两种有关物质的3号溶液各20 ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取20 μl注入高效液相色谱仪，计算焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）的加样回收率，结果分别为100.2%，99.8%；RSD（n=6）分别为1.0%，1.2%。
2.8 样品测定
精密称取本品适量，加水溶解并稀释制成每1毫升约含甘氨酰-L-谷氨酰胺2 mg的溶液，作为供试品溶液；分别精密称取焦谷氨酸、环（甘氨酰-L-酪氨酸）对照品约20 mg，置同一10 ml容量瓶中，加水溶解并稀释到刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液；精密量取上述两种溶液各1 ml，置同一100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，环（甘氨酸-L-酪氨酸）和焦谷氨酸按外标法以峰面积计算，结果自制样品的环（甘氨酸-L-酪氨酸）和焦谷氨酸的含量分别为0.006%，0.004%。
3 讨论
本试验中曾选用多种色谱柱，经比较柱压、保留时间、拖尾因子等因素，最终采用本实验所用色谱柱。
对于含有多种有关物质的甘氨酰-L-谷氨酰胺，控制产品的质量较困难。本文通过上述色谱条件，提供了一种准确、灵敏、快速的测定甘氨酰-L-谷氨酰胺有关物质的方法。
[参考文献]
[1]《化学药物杂质研究的技术指导原则》课题组.化学药物杂质研究的技术指导原则[S].2005.
[2]中华人民共和国国家药典委员会.《中国药典》2005年版附录增修订内容汇编（2005年版二部附录）[S].北京：化学工业出版社，2005.
[3]北京市药品检验所.复方氨基酸（15）双肽（2）注射液质量标准[S].
（收稿日期：2007-12-13）
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