冠心平对急性缺血犬心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

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摘 要：目的：研究冠心平对冠脉结扎导致心肌缺血犬心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法：36头Beagle犬，分成假手术组，心肌缺血模型组，心可舒组，小、中及大剂量冠心平组。前两组分别给予空白胶囊，其他各组每日两次口服相应剂量的药物，连续给药10天，10天后进行冠状动脉结扎实验。结扎180min后取心肌切片保存，检测心肌细胞凋亡指数（AI），并用免疫组化法检测心肌组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：与模型组相比，心可舒组及冠心平小、中、大剂量组的心肌凋亡指数水平均有所下降，Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减少，与模型组比较均具有统计学意义（P

关键词：冠心平；心肌缺血；细胞凋亡；凋亡指数；Bax；Bcl-2；Bcl-2/Bax

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0121-03

The Impact of Guanxinping on the Cardiocytes Apoptosis and the Expression of

Bcl-2 and Bax in the Acute Cardiac Ischemic Canine Model

LI Lianjing1,2，LI Qiyi1,ZHU Xuanxuan1,YAN Shihai1,ZHU Changle1,WANG Haidan2,ZHU Wuyuan2,WAN Meng2

(1.Jiangsu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjiang 210029,Jiangsu,China;

2.Nanjing University of Tranditional Chinese Medicine,Nanjiang 210029,Jiangsu,China)

Abstract:Obsjective:To investigate the impact of Guanxinping on the cardiocytes apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax in the cardiac ischemic canine model.Methods:36 canine dogs were assigned into sham procedure group, cardiac ischemic group, xinkeshu group, and small dose of Guanxinping，median dose of Guanxinping and large dose of Guanxinping group. Before the procedure, the groups were pretreated with control blank capsules, blank capsules, xinkeshu, small dose of Guanxinping, median dose of Guanxinping and large dose of Guanxinping, respectively, for ten days. The cardiac ischemic model was created by ligating a coronary artery, while the sham dogs with the same artery isolated but not ligated. After 180 minutes of ligating, the cardiac tissues were collected from the ligated area. The apoptosis index(AI) of the cardiac myocytes was determined and the expression of the Bcl-2 and Bax were measured by immunohistochemistry.Results:Compared with the control group, the AI of the xinkeshu group, small dose Guanxinping group, median dose of Guanxinping group and large dose of Guanxinping group significantly decreased, while the expression of Bcl-2 and Bax increased.(P

Key words:Guanxinping; ischemic; apoptosis; apoptosis index; Bax; Bcl-2; Bcl-2/Bax

细胞凋亡（apoptosis）是在基因调控下的细胞主动死亡过程。大量的动物实验研究及心肌梗塞死亡病例心脏标本的研究揭示[1-2]细胞凋亡在心肌缺血损伤的病理演变过程中占有重要的地位。甚至有研究证明，在急性心肌缺血早期，凋亡是心肌细胞死亡的主要形式，并伴随着心肌损伤病理演变的全过程，细胞凋亡不仅决定着心肌梗塞范围的大小，梗塞后心室重构，而且很可能是缺血性心脏病演变为心力衰竭的细胞学机制[3-4]。因此 ,干预心肌细胞凋亡的发生在心肌缺血损伤的防治研究中具有重要的临床和病理学意义。冠心平是江苏省中医院治疗心肌缺血的院内制剂，临床疗效显著[5-6]，但是冠心平对心肌细胞凋亡是否具有干预作用，还未见研究。本研究通过观察冠心平对急性心肌缺血犬心肌细胞凋亡、以及bcl-2、bax蛋白表达的影响，旨在探讨冠心平在该方面的作用及可能机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

①冠心平：由江苏省中医院制剂部提供，批号：100330；②心可舒片：山东沃华医药科技股份有限公司，批号：091273；③Bcl-2免疫组化试剂盒：博士德生物公司提供（BA-0315）；④Bax免疫组化试剂盒：博士德生物公司提供（BA-0412）④即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒：福州迈新生物公司提供（KIT-5030）。⑤DAB显色试剂：福州迈新生物公司提供。⑥TUNEL试剂盒（过氧化物酶法）：由德国罗氏公司提供（CAT No：11684809910）。

1.2 实验动物

健康Beagle犬，雌雄兼用，体重（10±2）kg，由扬州四方实验动物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2008-0006。

1.3 实验仪器

①动物呼吸机：ALC-V10，上海奥尔科特生物科技有限公司；② SP-756PC型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；③ LDZ5-2型离心机：北京京立离心机有限公司；④ TP 1020自动脱水机：德国LEICA公司产品；⑤RM2235型石蜡切片机：德国LEICA公司产品；⑥Tissue-Tek TEL组织包埋中心：日本SAKURA公司产品；⑦LEICA DM-1000光学显微镜：德国LEICA公司产品；⑧MiniSee图像采集系统；⑨康克新柏图文分析软件。

2实验方法

2.1 分组与剂量

取健康Beagle犬36只，雌雄兼用，随机分为6组，每组6只。假手术组和心肌缺血模型组每日两次口服空白胶囊，其他各组每日两次口服相应剂量的药物，连续给药10天，10天后进行冠状动脉结扎实验。给药剂量分别是心可舒组为0.36g/kg；冠心平大剂量组为6.7g/kg；冠心平中剂量组为3.35g/kg；冠心平小剂量组为1.675g/kg。

2.2 造模[7-8]及检测指标

取健康Beagle犬，称重后以2%戊巴比妥钠30mg/kg小隐静脉注射麻醉，背位固定，监测肢体Ⅱ导联心电图。切开颈部皮肤，气管插管，连接动物呼吸机，维持正常通气。分离股动脉、股静脉。股动脉插管并与压力换能器相连监测平均动脉血压、心率变化。股静脉插管，滴注0.9%氯化钠注射液。然后右侧卧位固定，于左侧第4肋间开胸，暴露心脏，分离冠状动脉左前降支（LAD）第二分支处穿线以备结扎用，行冠状动脉两步结扎法，建立Beagle犬急性心肌缺血模型。假手术组只穿线不结扎，冠心平各剂量组和阳性对照组的操作方法与模型对照组相同。结扎15min后经十二指肠给予已配制好的等体积实验药物或生理盐水。完全结扎180min后，取下心脏，生理盐水冲洗，在冠状动脉结扎线下1cm处，取少许左室前壁心肌组织，用10%福尔马林液固定后，分别进行心肌组织病理观察、TUNEL法检测坏死心肌细胞凋亡指数（AI）及免疫组化法检测Bcl-2、Bax基因蛋白表达。

2.3心肌组织病理形态观察

10%福尔马林固定后的心肌组织，每组随机取6个标本，脱水透明，石蜡包埋，常规切片4μm。苏木素-伊红染色（HE）法染色。光镜下观察各组形态学改变。

2.4心肌细胞凋亡检测

应用改良的末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法，原位标记心肌凋亡细胞核中的脱氧核糖核苷酸片段3’-OH末端显示心肌凋亡细胞的存在。正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。每只犬取6张切片，按说明书操作。阳性对照用双蒸水代替试剂盒中的反应混合物，不用苏木素复染，其余步骤不变。每张切片计数5个高倍镜（×400）视野中的凋亡阳性细胞核数、总细胞核数，取其比值的平均值为AI。

2.5 心肌Bax和Bcl-2基因蛋白表达检测

采用SP免疫组化法检测Bax和Bcl-2蛋白表达，以PBS替代一抗为阴性对照。具体方法按试剂盒说明书进行操作。每张切片随机测定5个视野取平均值，以其作为切片的测定值。Bax和Bcl-2蛋白表达均位于心肌细胞浆，呈棕黄色颗粒状。所有标本均采用捷达图像分析系统进行吸光度值（A值）测定。切片阳性表达的强弱与A值呈正相关，A值大则阳性表达强，反之依然。

2.6 统计学处理

统计学处理数据用（±s）表示，采用t检验，用 SPSS 16.0统计软件进行统计分析。

3实验结果

3.1心肌组织病理学变化

假手术组心肌形态规则，排列整齐，细胞未见水肿变性，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生，模型对照组主要表现局部区域心肌梗死，梗死区心肌纤维溶解断裂，呈小片状或小灶性坏死，周围有较多淋巴细胞浆细胞浸润，并见肉芽组织形成，部分区域纤维组织增生，瘢痕形成。各给药组未见明显梗死灶，纤维组织增生及炎细胞浸润，可见局部或灶性区域心肌水肿，心肌纤维断裂，相对于阴性对照组各给药组均能减轻心肌组织损伤的作用，以冠心平大剂量组效果最好。

3.2心肌细胞凋亡指数分析 见表1。

表1可见，假手术组凋亡细胞表达最少，模型组出现大量心肌细胞凋亡，与假手术组比较差异有显著性意义（P

3.3心肌Bax与Bcl-2的蛋白表达分析 见表2。

表2可见，冠脉结扎所致的急性心肌缺血犬，与假手术组比较，其Bax基因蛋白表达明显增加，而Bcl-2基因蛋白表达明显减少（P

4讨 论

越来越多的证据表明Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中的发挥着重要的作用[9]。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白如 Bcl-2、Bcl-xl等和促凋亡蛋白如Bax、Bad等。普遍认为Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白之间的相互作用结果是决定细胞生存或死亡的关键因素[10-11]。抗凋亡蛋白Bcl-2通过与促凋亡蛋白Bax结合形成异二聚体而发挥抗凋亡作用。当Bax蛋白表达增强时，Bax可以形成同源二聚体,促进细胞通过细胞凋亡而死亡[12]。Bad竞争性地与Bcl-2蛋白结合,促使Bax从与Bcl-2构成的异二聚体中解离,形成同源二聚体而发挥促凋亡作用[13]。由此可以看出,胞浆中Bcl-2家族蛋白抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的相对含量是决定某一特定细胞生存或死亡的决定性因素。亦有文献报道[14]细胞是否凋亡亦与Bcl-2/Bax的比值有关，当比值增加，细胞凋亡受抑制，反之则使细胞凋亡增多。

冠心平是我院根据长期临床经验，结合文献整理，按君臣佐使原则，选用黄精、当归、三七、瓜蒌皮、甘松五味益气养阴、活血祛瘀、化痰通络、行气止痛之药组成的复方制剂。本方源自古方当归补血汤（《兰室秘藏》）加减。全方药物性味平和，攻补兼施，标本兼顾，甚切冠心病气阴两虚、痰瘀互阻之病机。实验结果显示，冠心平治疗组犬心肌细胞凋亡发生率较模型组显著减少，且具有一定的量效关系，这也进一步证实了心肌细胞凋亡在心肌缺血损伤病理改变中起到不可忽视的作用。本实验应用原位末端标记法进行了细胞凋亡的检测，同时应用免疫组化的方法检测了Bax、Bcl-2的基因蛋白表达，结果显示，模型组犬心肌细胞凋亡发生率较高，同时Bax的表达明显上升， Bcl-2的表达明显下降。而与模型组比较，冠心平组对Bax表达显著减轻，Bcl-2蛋白表达则增强，Bcl-2/Bax的比值增加，进一步表明冠心平对心肌缺血损伤时凋亡相关基因蛋白的表达具有显著的调节作用，从而减轻了因急性缺血而引起的细胞损伤。显示冠心平可抑制细胞凋亡，从而减轻缺血时细胞凋亡对心肌的损伤。

参考文献

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