中药复方对糖尿病肾病大鼠肾皮质胞外调节蛋白激酶活性的影响
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摘要：目的：观察中药复方对糖尿病肾病大鼠肾皮质中磷酸化胞外调节蛋白激酶活性变化、脂质代谢、氧化-抗氧化系统及肾脏病理变化的影响。探讨中药复方对糖尿病肾病肾脏的保护作用机制。方法：雄性Wistar大鼠33只，随机取出10只为正常组，其余大鼠用高糖高脂饲料喂养1个月后，腹腔注射链脲佐菌素建立早期糖尿病肾病模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、中药治疗组。中药复方水煎剂浓度：2kg/L生药，中药组在成模后2周开始给药［20.30g/（kg•d）］灌胃；正常对照组及模型组灌服相应容量（10mL/kg）的生理盐水，1次/天，连续6周。检测血糖(GLu)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、尿微量白蛋白(uALB)、肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，用蛋白质印迹杂交方法(Western Blot)检测肾皮质磷酸化胞外调节蛋白激酶(pERK)水平，并观察肾组织病理变化。结果：治疗组GLu、TC、TG、LDL、uALB、MDA的水平比模型组均降低，肾组织中SOD水平比模型组升高。肾皮质中pERK水平比模型组明显下调，肾组织病理变化相应减轻。结论：①胞外调节蛋白激酶参与了糖尿病肾病的发生与发展；②胞外调节蛋白激酶活化与糖尿病肾病高血脂和氧自由基有关；③中药复方对糖尿病肾病肾脏的保护作用，可能与抑制胞外调节蛋白激酶活性、降低高血脂有关；并对肾内活性氧代谢具有调节作用。
关键词：中药复方；糖尿病肾病大鼠；磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2008）04-0832-04
糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾衰的最主要原因之一，迄今为止，DN确切发病机制尚未完全阐明。最近研究发现胞外调节蛋白激酶(ERK)与糖尿病肾病的发生与发展有密切关系。ERK是细胞信号中传递丝裂原信号的关键激酶，当ERK激活后，可调节转录因子活性，产生细胞效应，参与DN细胞外基质的积聚。ERK在DN发病中的作用已受广泛关注。本实验观察中药复方对ERK在DN大鼠肾皮质中表达的影响及肾组织的病理改变，探讨其作用机制。
1材料和方法
1.1材料
用自动生化分析仪测定GLu、TC、TG、LDL；用放免法测uALB；黄嘌呤氧化酶法测SOD；硫代巴比妥酸法测MDA；SOD与MDA试剂盒由南京建成生物技术研究所提供。用Western Blot法检测肾皮质中pERK1/2(由大连宝生物工程有限公司提供)。
链脲佐菌素(STZ)：为美国Sigma公司产品，购于北京邦定泰克生物制药有限公司，临用前溶于0.1mol/L,PH4.2无菌枸橼酸钠缓冲液，配成1%溶液。
中药复方制剂：由黄芪、黄精、山药、大黄、丹参、茯苓、泽泻及益母草药物组成，购于总医院药局，由总医院中药局制剂室煎制（汤剂浓度：相当于生药2g/mL）。
1.2实验方法
Wistar大鼠33只，雄性，体质量（200±20）g，由总医院实验动物中心提供。动物使用许可证：SYXK(军2002-019)。
动物模型与分组：大鼠33只，适应性饲养1周。1周后随机取10只为正常对照组，给予普通饲料，余23只给予高糖高脂饲料，喂养1个月后造模。造模前禁食12h，然后以50mg/kg链脲佐菌素1次腹腔注射， 正常对照组注入等容量枸橼酸缓冲液。造模过程中死亡1只。血糖值大于16.7mmol/L的22只，列入观察对象。按血糖值随机将大鼠分为模型组与治疗组每组11只，另10只为正常对照组。中药治疗组剂量按人体-大鼠体表面积比值换算出大鼠的等效剂量。治疗组给予20.30g/（kg•d）灌胃（1mL/100g体重）；正常对照组及模型组灌服相应容量（1mL/100g体重）的生理盐水, 各组每天灌胃1次, 连续6周。实验期间自由饮水，未使用胰岛素和其它降糖药。
肾脏病理检查：取肾脏组织，进行光镜和电镜形态学观察。
采用蛋白质印迹杂交法检测磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2。
1.3主要观察指标
血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、尿微量白蛋白、肾组织中超氧化物歧化酶、丙二醛、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2 。
1.4统计学处理
实验结果均采用±s表示。用SPSS Ver10.00统计软件用两组均数比较t检验及相关分析，以P
2实验结果
2.1各组大鼠治疗后uALB TC TG LDL的比较
见表1。各组大鼠在治疗期间均未用降糖药。模型组、治疗组与正常组比较uALB、TC、TG、LDL均明显升高（P
2.2各组大鼠治疗后SOD MDA的比较
见表2。模型组与正常组比较SOD显著降低（P
2.3各组大鼠治疗后磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2(pERK1/2)用蛋白质印迹杂交方法检测结果
见图1。模型组、治疗组与正常组比较pERK1、pERK2均明显上调。治疗后上述指标比模型组比较均有明显下调。
2.4肾组织病理变化
2.4.1光镜观察正常组大鼠肾小球结构完整，未见肾小球增大及异常改变。模型组大鼠肾小球系膜细胞、基质增生，系膜区增宽，毛细血管壁增厚。肾小球增大，部分肾小球毛细血管襻周缘部分出现嗜伊红的蛋白物质沉积。治疗组肾组织的病理变化较模型组减轻。见图2～5。
2.4.2电镜观察肾组织超微结构变化(1)正常对照组:肾小球基底膜内、中、外3层结构清晰完整, 血管内皮细胞、足细胞、系膜细胞未见异常。(2)模型组:肾小球基底膜3层结构不清, 血管内皮细胞、系膜细胞肿胀变性，足突部分断裂、融合。系膜区增宽、基质增多、基底膜呈不规则增厚。(3)治疗组较模型组减轻。系膜区增宽、基质增多、基底膜增厚均有所减轻。足突部分融合。见图6～8。
3讨论
3.1磷酸化胞外调节蛋白激酶(ERK)
包括两个高度同源的亚类ERK1/2。ERK激活后一部分保留在胞浆中，可磷酸化一系列胞浆蛋白；另一部分移位到胞核，活化一系列转录因子、信号传导与转录活化因子等［1］。ERK的激活在DN的发生发展中起重要作用。本实验结果显示模型组大鼠pERK的水平明显高于正常对照组，肾脏细胞增生肥大、细胞外基质增多等病理改变与ERK的激活关系密切［2-3］。提示中药复方对肾脏的保护作用可能部分通过抑制胞外调节蛋白激酶的活性而实现的。目前糖尿病肾病胞外调节蛋白激酶激活机制尚不清楚。本文从高血脂、氧自由基水平观察对胞外调节蛋白激酶的影响，探讨胞外调节蛋白激酶的激活机制和中药复方对肾脏的保护作用。
3.2血脂与胞外调节蛋白激酶
高血脂可作为DN发生的独立危险因素，引起肾脏损伤，导致肾小球硬化［4］。尤其是LDL对肾脏的作用最为明显，可刺激肾小球系膜细胞产生炎症介质，分泌系膜基质增多，促进肾小球上皮细胞增殖和粘连蛋白分泌。本实验结果显示模型组大鼠TC、TG、LDL及uALB比正常组明显增高，中药复方治疗后TC、TG、LDL及uALB明显降低，这一结果和有的学者报道相一致［5］。还有研究表明，修饰（氧化或糖基化）低密度脂蛋白（LDL）可激活系膜细胞中的ERK活性，其上游途径可涉及到Src家族蛋白激酶介导的Ras激活［6］。本实验结果显示，MDA水平与uALB有明显相关性。提示肾内抗氧化酶能降低脂质过氧化物堆积，认为肾内氧自由基生成和清除平衡被破坏可能在DN发生，发展中起重要作用。
3.3氧自由基与胞外调节蛋白激酶
在正常情况下，机体内自由基的产生与消除保持动态平衡。当自由基产生过多或清除能力下降，在体内积聚时，会使脂质 蛋白质及核酸受损害，导致细胞结构破坏。在糖尿病状态下，氧自由基增多对DN的发生和发展起重要作用。本研究结果显示模型组大鼠肾组织中MDA 增多，表示自由基生成增多，SOD减少，表示清除氧自由基能力下降。用中药治疗后 MDA 减少，SOD 活性升高。证实了中药对肾内活性氧代谢具有调节作用。但其抗氧化机制目前尚不十分清楚。笔者推测抗氧化机制部分与纠正脂代谢紊乱，上调SOD活性有关。最近有学者报道，多种细胞因子诱导的系膜细胞中氧化应激产物增多，可激活ERK,进而导致细胞增殖［7］。用抗氧化剂 -硫辛酸对其有抑制作用［8］过氧化氢也可活化系膜细胞中的ERK，血小板衍化生长因子对其有协同作用［9］。中药复方通过对磷酸化ERK在糖尿病肾病肾皮质中表达的影响及与高血脂 ，氧自由基之间相互关系的探讨，揭示其作用机理，为糖尿病肾病的防治提供科学理论依据。
总之，本中药复方依据DN早期气阴两虚，痰浊血瘀基本病机，采用益气养阴，祛痰活血化瘀的基本治疗大法，治疗后明显减轻DN肾脏病理变化。其机理可能与降血脂，减少氧自由基，明显抑制ERK的活性有关。提示中药复方对DN肾脏的保护作用可能部分通过抑制ERK 的活性而实现。
参考文献
［1］Tian W,Zhang Z,Cohen DM.MAPK signaling and the Kidney［J］. Am J Physiol Renal Physiol,2000,279(7):F593-F604.
［2］toyoda M,Suzuki D,HonmaM. High expression ofPKC-MAPK pathway mRNAs correlates with glomerular lesions in human diabetic nephropathy［J］. Kidney Int, 2004,66(3):1107-1114
［3］Sskai N,Wsda T, Furuichi K.Involvement of extracellular signalregulated kinase and p38 in human diabetic nephropathky［J］. Am J Kidney Dis,2005,45(1):54-65.
［4］王惠芳，白晓宁，何华，等.血脂异常对2型糖尿病的影响［J］.西安医科大学学报，2002，23（3）：280-282.
［5］程晖，贾汝汉，刘红燕.黄芪对糖尿病大鼠肾脏的保护作用［J］.中国医师杂志，2006，8（10）:1349-1351.
［6］Jenkins AJ，Velarde V，Klein RL,et al. Native and modified LDL activate extracellular signal-regulated kinases in mesangial cells［J］.Diabetes,2000,49(12):2160-2169.
［7］BudisavljevicMN,Hodge L,Barber K,et al.Oxidative stress in the pathogenesis of experimental mesangial roliferative glomerulonephritis［J］. Am J Physiol RenalPhysiol, 2003, 285(6): F1138-1148.
［8］Hayama M,Inoue R,Akiba S , et al.ERK and p38 MAP kinase are involved in arachidonic acid release induced by H2O2and PDGF in mesangial cells［J］. Am J Physiol Renal Physiol, 2002, 282(3):F485-F491.
［9］Lin CL, Wang FS,Kuo YR,et al.Ras modulation of superoxide activates ERK-dependent fibronectin expression in diabetes- induced renal injuries［J］. Kidney int,2006,69(9):1593-1600.