用标样比对法鉴定放线菌提取物中的主要活性成分
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摘要：在新型农用抗生素的筛选工作中，对部分具有广谱抗真菌活性的放线菌提取物HPLC-MS检测数据进行分析后，得到紫外吸收及质谱碎片等光谱学信息，根据天然产物数据库比对结果，疑为环已酰亚胺。将环已酰亚胺标准样品在相同条件下分析，得到的紫外吸收光谱及质谱碎片信息与检测样品几乎完全一致。由此推断曾疑似未知的主要活性化合物为环已酰亚胺。采用该方法可快速准确地对活性化合物进行鉴定，从而大大提高筛选效率。
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5760-04
近年来，由于农药滥用导致的食品安全事故频发，如海南省毒节瓜、毒韭菜事件，山东省毒生姜事件等，因而生物农药的研究及产业化开发引起全社会的普遍重视[1]。在众多的生物农药类别中，农用抗生素是一类由微生物产生的次级代谢产物，具有效果明确、容易生产、环境污染少等优点，因而从微生物资源中寻找具有开发前景的新型农用抗生素对促进生物农药的产业化具有重要意义。自青霉素问世以来，人们对抗生素的研究已持续80多年。迄今发现的约30 000种抗生素中，源自微生物的种类约有17 000种[2]。放线菌作为最重要的抗生素产生菌，经过国内外多年广泛的筛选，目前发现新抗生素的机率在1%以下甚至更低，因而在抗生素的筛选过程中，重复发现的比例非常高，对这些化合物进行早期鉴定和剔除对农用抗生素的开发意义重大。
在抗生素早期鉴定中，一般利用化合物的紫外吸收光谱、质谱等信息，有些化合物甚至凭紫外光谱就能判断，比如多烯类抗生素。对于一些没有明显紫外吸收的化合物，仅凭质谱数据很难做出判断。对于某些化合物，采用市售标准样品在相同条件下进行检测，根据保留时间、紫外光谱、质谱碎片等信息，可快速准确地鉴定未知化合物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 放线菌HBERC-15000～32510，分离自全国各地采集的土样，由湖北省生物农药工程研究中心保藏。生物活性测定指示菌：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、立枯丝核病菌Rhizoctonia solani、黄色镰刀菌Fusarium culmorum、小麦颖枯病菌Septoria nodorum、番茄早疫病菌Alternaria solani等。
1.1.2 培养基 斜面培养基： ISP-2培养基。采用18 mm×180 mm 玻璃试管，每管装琼脂培养基8～10 mL。 种子培养基：同ISP-2，不加琼脂。采用500 mL带档板三角瓶，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min。发酵培养基：分为A、B两种培养基，主要成分为葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉、大豆蛋白粉等。采用500 mL带挡板三角瓶，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min。
1.1.3 主要设备及软件 冰冻干燥机，Ly-0.8型，上海东富龙科技有限公司生产；Waters高效制备色谱仪（Waters 2525泵，带2767自动收集系统，2996二极管阵列式检测器）；Waters 2695型高效液相色谱仪（Waters 2996 二极管阵列式检测器），Micromass Quattro micro？誖质谱仪（电喷雾离子源ESI），Masslynx V4.1液质联用分析软件，查普曼（Chapman）天然产物数据库2003版。
1.2 方法
1.2.1 菌株摇瓶发酵 在严格无菌条件下，从斜面取面积为8～10 mm2的一块菌苔转移至种子摇瓶中，在28 ℃，150 r/min旋转式摇床上，振荡培养72～96 h，然后按10%（V/V）的接种量转接至发酵培养基中，在28℃，150 r/min旋转式摇床上，振荡培养100～120 h，即完成发酵。
1.2.2 发酵液冻干及提取 将发酵液转移至不锈钢冻干杯中，置冻干机中冰冻干燥，冻干条件：-40 ℃预冻2 h，冷阱预冷至-45 ℃以下，开启真空泵升华（真空度为10～30 Pa，升温速率为2～3 ℃/h，极限温升为37 ℃）。取出冻干粉后，转移至三角瓶中，先用少量50%甲醇-水湿润，再加入100 mL乙酸乙酯，于摇床上180 r/min振荡萃取1 h，分离出酯相，旋蒸，除去溶剂，再以少量甲醇溶解后，送HPLC-MS分析。
1.2.3 提取物生物活性测定 取一定量发酵提取物，加入DMSO溶解，再以纯水稀释至一定浓度后，用96孔板进行生测。组分生测采用同样的生测靶标及方法。CK为空白培养基提取物。
1.2.4 活性提取物液质联用分析 采用Sunfire C18色谱柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒径3.5 μm，柱温40 ℃，进样量为2 μL，流动相为超纯水和色谱纯乙腈，梯度洗脱。质谱检测条件：电喷雾电离（ESI），毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压70 V，离子源温度100 ℃，干燥气温度300 ℃，脱溶剂气体流速500 L/h，锥孔气体流速50 L/h。
1.2.5 提取物的鉴别 根据组分生测结果，确定活性成分的保留时间，从HPLC-MS图谱中获得活性物质的紫外吸收光谱，确定吸收峰的波长。从ESI图谱中可判定目标产物的分子离子峰，从而确定相对分子量。将吸收峰波长及相对分子质量输入Chapman天然产物数据库，查询同该物质性质相同或相近的化合物名称及其化学结构，并进行理化及生物学性质比对，从而判定活性化合物的种类及其化学结构。
1.2.6 标样配制与HPLC-MS分析 环已酰亚胺标准样品：Sigma产品，纯度>94%。称取环已酰亚胺标准样品1.0 mg，加入1 mL甲醇溶解，即配制成1 mg/mL环已酰亚胺标准溶液。采用与上述样品完全相同的分析条件进行HPLC-MS联用分析。
2 结果与分析
2.1 部分放线菌提取物生物活性测定结果
表1中活性数据多数为7和9，表明上述菌株的发酵提取物具有广谱的抗真菌活性。
2.2 对提取物的HPLC-MS数据分析
典型的菌株HBERC-16300A，其HPLC-MS图谱见图1。经对提取物的HPLC-MS图谱进行分析，发现它们有着共同的特征，在Rt=17.5 min有一明显峰，其紫外吸收波长λmax=221，262，346 nm，相对分子质量293 u。将其制备，得到此峰的纯品，经生物活性测定，该产物未见明显活性。
2.3 对HPLC-MS图谱中未知小峰的分析
对图1进行仔细分析后，发现在Rt=13.76 min有一常见培养基杂质峰，其附近Rt=13.60 min有一未知小峰，其紫外及质谱数据如图2、图3所示：根据质谱图及化合物的质谱特征，可以确定该化合物在正负离子模式下的分子离子峰分别为[M-H]+=280.5 u，[M-H]+=282.6 u，由此可确定其相对分子质量约为281.5 u。其紫外无明显吸收峰，属末端吸收。与数据库比对结果，最可能的化合物为Piperdinedione，即环已酰亚胺（Cycloheximide），俗称放线菌酮。
2.3 环已酰亚胺标准样品分析结果
将环已酰亚胺标样用甲醇配制成1 mg/mL的浓度，HPLC-MS检测结果如图4所示。环已酰亚胺标样的紫外及质谱图如图5、图6所示：比较样品中Rt=13.60 min化合物及标样的紫外吸收光谱及质谱图可以看出，二者紫外吸收光谱非常相似，质谱中离子碎片也非常相近，且质谱仪检测到的碎片峰也相当一致，只是质量数有些许差别，完全在质谱仪误差范围之内。由此可以判定，放线菌发酵提取物中Rt=13.60 min的化合物为环已酰亚胺。
3 小结与讨论
在得到环已酰亚胺的HPLC-MS分析数据后，笔者对以前认为是含有未知化合物的高活性提取物进行仔细分析，发现其中很多含有环已酰亚胺。表1中的菌株均产生该化合物。由于产生该化合物的菌株比例很高，此数据对活性化合物的快速筛选和鉴定具有重要意义。经过比对，笔者在短时间内对具有广谱抗真菌活性的化合物进行了快速鉴定，从数百个高活性化合物中排除了含有环已酰亚胺的提取物共计38个，大大提高了活性化合物的鉴定速度。
放线菌酮是20世纪60-70年代很有名的农用抗生素[3]，曾广泛用于农作物真菌病害的防治，如公主岭霉素（农抗769）[4]、内疗素[5]、农抗11874[6]、农抗101等，其主要活性成分均为放线菌酮。即使在今天，仍然有发现放线菌酮的报道[7，8]。但放线菌酮对一些农作物具有药害，因而其使用受到限制。除放线菌酮之外，笔者用标样比较法快速准确地鉴定了提取物中的四环素、红霉素、纳他霉素、制霉菌素等化合物，该方法对缩短研究周期，提高科研工作效率意义十分重大。
参考文献：
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[2] BERDY J. Bioactive microbial metabolites[J]. J Antibiotic（Tokyo），2005，58（1）：1-26.
[3] 胡启山.农用抗菌素及其应用技术[J].农药市场信息，2009（21）：30.
[4] 高荣先.769抗菌素的分离和鉴定研究[J].吉林农业科学，1988（4）：37-43.
[5] 尹莘耘.农业抗生素的进展[J].抗生素，1979（12）：67-68.
[6] 张良键.推广“农抗11874”防治禾谷类作物黑穗病[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社，1987.
[7] 陈义光，刘祝祥，李铭刚，等.产环己酰亚胺新菌株YIM41004种子培养基优化研究初报[J].云南大学学报（自然科学版），2006（2）：173-177.
[8] 杨宴霞.放线菌SPRI_710055次级代谢产物中除草活性成分研究及菌种鉴定[D].上海：上海师范大学，2009.