斑点杂交法检测正畸大鼠三叉神经节PPTAmRNA的变化

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[摘要]目的：观察正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节（Trigeminal Ganglion ，TG）中前速激肽原A（PPTA）mRNA的表达变化，初步探讨牙齿移动导致疼痛的可能机制。方法：采用斑点杂交的方法检测正畸加力后不同时期大鼠TG内PPTAmRNA水平的变化情况。结果：加力2h大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达量开始增加，加力8h至加力3天达到最高，至第7天 PPTA mRNA水平仍然明显高于对照组。结论：正畸牙齿移动能导致TG内pptamrna表达水平的上调，提示PPTA可能参与了正畸疼痛的发生。

[关键词]P物质；前速激肽原A（PPTA）；牙齿移动；正畸疼痛；三叉神经节（TG）；斑点杂交

[中图分类号]R332 R783.5 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0067-02

Changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement using Dot-blot hybridization method

YIN Yue，SUN Ying-ming

（1.Anhui Medical University，School of Stomatology，Hefei 230032，Anhui，China； 2.Department of People's Liberation Army 101 Hospital Dental，Wuxi 214044，Jiangsu，China）

Abstract： Objectives To investigate the changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement. Methods The changes in the expression of PPTA mRNA in the rat trigeminal ganglion，during tooth movement in different periods，were detected using Dot-blot hybridization. Results The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion was stonger than that in blank group and control group at all the time points； PPTA mRNA level was increased after 2 hours and reached the peak level around 8 hours to 3 days during tooth movement，7days after tooth movement PPTA mRNA level was still higher than in control group. Conclusion Orthodontic tooth movement can lead to a stonger expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion， suggesting that the PPTA may be involved in the occurrence of orthodontic pain.

Key words：substance P；PPTA；tooth movement；orthodontic pain；trigeminal ganglion；Dot-blot hybridization

疼痛是正畸治疗中的一个常见反应[1]。正畸治疗中牙齿疼痛与不适主要来源于牙周组织在改建时释放的疼痛介质，是一个复杂的综合性生理过程。而P物质（Substance P，SP）是发现最早的神经肽，目前已证实SP参与痛觉的传递[2]。牙齿及牙周组织中的SP是由三叉神经节（Trigeminal Ganglion ，TG）合成，PPTA是编码SP的前体。在牙齿移动中，三叉神经节SP阳性神经元可能发生相应的改变。我们采用斑点杂交的方法检测正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节内PPTAmRNA表达水平的变化，探讨正畸牙齿移动导致疼痛的可能机制。

1 材料和方法

1.1实验分组、动物模型制备和取材：SD雄性大鼠，体重（180±20）g（7～9）周。加力装置采用结扎丝将一根镍钛螺旋拉簧一端扎在上颌第一磨牙上，另一端结扎在上颌中切牙上，并用自凝塑料加固结扎丝与牙连接处。加力力值为50g，使磨牙向近中移动。大鼠随机分为实验组（安置装置加力）、对照组（安置装置不加力）。将实验组和对照组根据不同时间分为以下亚组：2h组，8h组，1天组，3天组，7天组。每组5只大鼠，共50只大鼠。待大鼠达到规定时间点后，将动物乙醚吸入麻醉后迅速断头取三叉神经节，放入液氮中速冻。

1.2 组织总RNA的提取：采用异硫氢酸胍一步法提取大鼠三叉神经节总RNA。RNA纯度260/280比值>1.9。

1.3 斑点杂交（Dot blotting）检测：取总RNA加等体积的RNA变性液65℃变性30min。取10μg变性RNA点于尼龙膜，室温静止20min，按照1.5J/cm2 254nm波长紫外线照射1.8min待用。实验用探针序列与大鼠脑内PPTAmRNA的第175号碱基到第204号碱基互补（5′-gatga tctaa attat tggtc cgact ggtcc -3′）。将尼龙膜和预杂交液封于杂交袋中，42℃预杂交16h，将标记探针2μg加入杂交袋中，42℃，12h。洗膜后探针检测采用酶标抗地高辛抗体（过氧化物酶系统），DAB显色。扫描仪扫描，计算个样本灰度值。

1.4 统计学方法：实验数据采用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果用x±s表示，组组之间采用t检验分析，P

2 结果

斑点杂交检测结果显示不同时间点各对照组之间未发现显著性差异；在正畸牙齿移动过程中大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达发生了明显的变化，并具有一定的规律性。加力2h大鼠三叉神经节PPTA mRNA的表达量开始增加，加力8h至加力3天达到最高，至加力7天时PPTA mRNA水平仍然明显高于对照组和空白组（P

3 讨论

SP是最早发现的神经肽，由11个氨基酸组成，是1931年Von Euler等在研究马体内乙酰胆碱时发现的一种物质。20世纪70年代分离纯化了SP，进而确定了其组织结构，同时SP也是牙髓组织中发现的第一个神经肽[3]。三叉神经节中存在SP阳性神经元，并且主要位于中小神经元内[4]。三叉神经节初级感觉神经元是疼痛的起始部位。传导口腔颌面部疼痛的初级感觉神经元位于三叉神经节。在牙齿移动中三叉神经节SP神经元兴奋，引起SP的释放，一方面释放至外周末梢参与疼痛的发生，另一方面向上至三叉神经脊束核尾侧亚核（caudal spinal trigeminal nucleus，VC）传递痛觉信息。

SP是公认的疼痛传递介质，具有增强伤害性信息传递的功能。SP被认为对疼痛信号的传递呈双重作用，在传人的神经元中为兴奋性介质，但在高级中枢神经及其调制中则降低疼痛的敏感度。Henry等[5]认为，SP作为神经递质在疼痛的感觉传递和镇痛机制中发挥着重要作用。在正畸治疗的初期，SP可能是导致牙齿轻微疼痛和不适症状的原因之一：（1）SP可使牙髓内局部血管扩张、通透性增加，髓腔内压上升以至牙髓微循环障碍，导致C纤维兴奋性增加，兴奋阈值降低；（2）SP可以介导产生内源性致痛物质，间接引起C纤维兴奋阈值降低[6]，如：①SP在C纤维支配的局部区域可引起血管扩张，通透性增加，血管内液体的深处可以激活缓激肽类物质；②SP作用于肥大细胞可使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等。SP的作用并不是孤立的，而是与神经系统及其它递质相互作用、相互配合而发挥作用的。另一方面，神经系统不同部位、不同程度的损伤，SP的含量也随着发生变化，通过测定SP的动态变化，可在一定程度上推测其功能的恢复情况。

本研究采用斑点杂交的方法观察正畸牙齿移动不同时期大鼠三叉神经节内PPTAmRNA水平的变化情况，从SP中枢合成和mRNA水平来揭示正畸疼痛的变化规律。研究发现加力2h后PPTAmRNA的表达量开始增加， 加力 8h至加力3天达到高峰，至加力7天后仍然明显高于对照组和空白组。该结果与Norevall的外周SP神经变化的发现相一致[7]。笔者发现大鼠正畸牙齿移动过程中三叉神经节PPTAmRNA的表达发生了明显的变化，表达水平上调，并具有一定的规律性，说明牙齿移动的刺激能增强PPTA在大鼠三叉神经元的表达，表明牙齿移动产生了疼痛反应。SP经轴浆运输到达三叉神经纤维外周端末梢并释放到牙髓或牙周组织，参与牙齿移动导致的疼痛反应，SP也可能到达三叉神经纤维的中枢端并向三叉神经脊束核释放，从而加强牙齿移动引起的痛反应。研究发现[8]：牙周疼痛发生时间在正畸加力后1～12h不等，平均为4～5h，在24～48h疼痛达到最高峰，加力后72h疼痛程度才逐渐减轻。可以看出，实际临床中患者的疼痛规律和本研究发现的TG中PPTAmRNA的变化规律呈一定的相关性。说明SP参与了正畸疼痛的发生，但具体的作用机制还有待进一步的研究。

[参考文献]

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[8]郑衍亮.固定正畸治疗时患者牙周疼痛影响因素的观察[J].中国行为医学科学，200l，10（4）：324-325.