狗脊不同炮制品水煎液抗维甲酸致雄性大鼠骨质疏松症研究

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[摘要]该研究比较了生狗脊、酒狗脊、盐狗脊、烫狗脊和蒸狗脊的水煎液HPLC图谱，在此基础上，以砂烫骨碎补水煎液为阳性组，又比较了各组灌胃水煎液（质量浓度为104.2 g・L-1）4周后对维甲酸致骨质疏松雄性大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP水平和作用机制指标血清护骨素OPG，血Ca和P，IL-6，TNF-α和IL-1水平及总评分的影响。结果表明，酒狗脊和砂烫狗脊效果较好，而蒸狗脊、盐狗脊以及生狗脊作用次之。在炮制方法的选择方面，加热方式中干热的砂烫法优于湿热的水蒸法，辅料中黄酒优于食盐。该结果为阐明狗脊炮制原理和抗骨质疏松症作用机制提供参考。

[关键词]狗脊；炮制品；水煎液；维甲酸；骨质疏松症；破骨细胞

中药狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的干燥根茎，味苦、甘，性温，归肝、肾经，各炮制品包括生狗脊（净制、切制）、烫狗脊、酒狗脊、蒸狗脊、盐狗脊等均具有增强“补肝肾，强腰膝”的功效，在临床上常用来治疗骨质疏松症[1-3]。已有研究表明狗脊及其炮制品对去卵巢致骨质疏松雌性大鼠及促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞活性均具有一定作用[2-6]，其中，从成骨细胞角度研究较多，而其影响破骨细胞作用方面研究甚少。本研究从维甲酸致雄性大鼠骨质疏松角度以整体动物为平台，以影响破骨细胞为研究目标，以检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP和计算作用机制指标总评分为评价标准，深入探讨其影响破骨细胞的作用效果和机制，并对狗脊各炮制品进行比较，弄清各自的作用差别，以供生产及临床灵活地辨别选用，同时为狗脊炮制原理的阐明和抗骨质疏松症作用机制提供参考。

1 材料

Waters e2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KES-21AS20型电陶炉（深圳市康佳电器有限公司）；FA1004B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；单道彩色移液器（Thermo公司）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo公司）；TGL-16C型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHA-C恒温振荡器（常州国华电器有限公司）。

SD雄性大鼠，体重180～220 g，由大连医科大学实验动物中心提供，生产合格证号SCXK（辽）2008-0002；维甲酸（上海泛柯实业有限公司，批号R0023，纯度≥98%）；生理盐水（黑龙江科伦制药有限公司）；大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP、白介素IL-6、血清中微量元素钙（Ca）和磷（P）、血清护骨素OPG、肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1等7种血清ELISA试剂盒（上海科兴贸易有限公司，批号201210）；其他试剂为色谱纯或分析纯。

生狗脊饮片和骨碎补饮片购自安徽省亳州市安东药业，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为蚌壳蕨类科植物金毛狗脊C. barometz（L.）J.Sm.的干燥根茎以及水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kze.）J.Sm.的干燥根茎；特制黄酒（即墨市古城春酒厂）；食盐（大连市盐业公司）；纯净水；净河砂等。

2 方法

2.1 给药样品的制备

2.1.1 狗脊不同炮制品及烫骨碎补的制备[7-8] 砂烫品：参照2010年版《中国药典》，按照优化的参数，取大小均匀、净制过的狗脊片90 g，置8倍量河砂的锅中加热至滑利状态（180～190 ℃），保持砂温，下药，边炒边埋，炒 6～7 min，出锅筛去砂，晾凉，备用。

蒸制品：取大小均匀、净制过的狗脊片90 g，置适宜容器内，加入清水40 mL到其中拌匀，盖保鲜膜，密闭浸润。之后放入蒸锅内，武火蒸制4 h，停火后闷制4 h，取出干燥。

酒制品：取大小均匀、净制过的狗脊片90 g，置适宜容器内，按100∶15比例加入黄酒，并用清水稀释至40 mL后，加入到狗脊片中拌匀，盖保鲜膜，密闭浸润。之后放入蒸锅内，武火蒸制4 h，停火后闷制4 h，取出干燥。

盐制品：取大小均匀、净制过的狗脊片90 g，置适宜容器内，按100∶2加入食盐，并用清水稀释至40 mL后，加入到狗脊片中拌匀，盖保鲜膜，密闭浸润。之后放入蒸锅内，武火蒸制2 h，稍，取出干燥。

烫骨碎补（阳性组）：参照2010年版《中国药典》，按照优化的参数，取大小均匀、净制过的骨碎补饮片90 g，置8倍量河砂的锅中加热至滑利状态（180 ℃左右），保持砂温，下药，边炒边埋，烫1～2 min（毛微焦时），出锅筛去砂，晾凉，撞去毛，筛净备用。

2.1.2 灌胃药液的制备 取狗脊各炮制品及烫骨碎补饮片，加10倍量水浸泡60 min后煎煮2次，每次1 h，滤过。合并滤液，浓缩滤液至质量浓度为104.2 g・L-1，即为临床建议成人用量最大量换算为大鼠的用量[8-9]。

2.2 狗脊各炮制品灌胃药液的HPLC分析

Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-1%冰醋酸溶液（5∶95），检测波长254 nm，流速1.0 mL・min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL。狗脊各炮制品HPLC图见图1。

2.3 动物分组、造模与指标检测[10-11]

大鼠64只，于室温25 ℃，湿度30%～50%，12 h光照/黑暗循环环境下适应性饲养1周。随机分为8组：空白组、模型组、阳性组、生品组、酒制品组、蒸制品组、砂烫品组、盐制品组。每天上午，每组大鼠按10 mL・kg-1（ig）给药或生理盐水；下午，除了空白组外，其他各组大鼠用1%羧甲基纤维素钠配成的维甲酸混悬液按70 mg・kg-1（ig）灌胃，空白组大鼠以1%羧甲基纤维素钠（ig）灌胃，连续2周后停用维甲酸，继续给药2周。大鼠末次给药后1 h，10%乙醚麻醉，腹主动脉取血，5 000 r・min-1离心10 min，取血清，-20 ℃冰箱中保存，待检测。采用ELISA试剂盒检测，严格按照试剂盒的说明进行操作。

2.4 统计学处理

实验数据用±s表示，结果用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 对维甲酸致骨质疏松大鼠血清s-TRAP，OPG，Ca和P水平的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清s-TRAP水平显著升高（P

与空白组比较，模型组大鼠血清OPG水平显著降低（P

与空白组比较，模型组大鼠血清微量元素Ca和P水平显著降低（P

3.2 对维甲酸致骨质疏松大鼠血清IL-6，TNF-α和IL-1水平的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6，TNF-α和IL-1水平均显著升高（P

3.3 狗脊各炮制品作用机制指标总评分

依据各组作用机制指标的单因素方差分析结果，为各炮制品的作用进行评分，评分规则为各组指标水平最接近空白组者计5分，次之者计4分，接下来依次递减1分，总评分高者为优。评分结果见表3。总评分排序为砂烫品（22分）>酒制品（19分）和盐制品（19分）>蒸制品（16分）>生品（14分）。

4 讨论

4.1 模型与指标分析

维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型虽然在病因上与人类骨质疏松不同，但在发病症状、组织形态学表现等方面与人类有较好的相似性，具有操作简单、造模周期短、成功率高等优点。维甲酸诱导形成的骨质疏松模型的发生机制为激活破骨细胞，促进骨吸收。血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP主要反映破骨细胞的活性和数量，是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的敏感指标[10]，实验中模型组s-TRAP显著增加，说明造模成功；狗脊各炮制品均可显著逆转这种变化，其与阳性组砂烫骨碎补作用亦接近，但均不及空白组。说明各炮制品对破骨细胞均有一定程度的抑制作用，从而对抗骨的丢失，促进了骨的形成。

中药狗脊具有祛风湿、抗炎的功效[12-13]，故本研究从炎性因子的靶点作用方向选取了相应检测指标，以深入探讨其作用机制。IL-6表达水平在组织损伤时增高明显，能通过抑制TNF-α，IL-1含量，来抑制成骨细胞成熟，增加骨吸收，是能够导致骨量减少的细胞因子[14]，狗脊各炮制品中以砂烫品效果最佳。TNF-α及IL-1均为体内具有抗炎作用等多种功能的细胞因子，二者可促进骨吸收，抑制骨基质胶原合成，狗脊各炮制品中生品对TNF-α影响最为突出，而蒸制品对IL-1水平影响最大。同时TNF-α和IL-1的升高可直接损伤肾血管-基底膜屏障，导致血管通透性增高，促使Ca和P代谢呈负平衡，从而影响骨形成，狗脊各炮制品中盐制品和砂烫品分别为Ca和P水平的相应最优炮制品。此外，TNF-α尚能抑制OPG（骨保护蛋白，具有对抗骨丢失的作用）的mRNA的表达，可减少破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞的数量，IL-1还能直接诱导破骨细胞形成[15]。同时，TNF-α和IL-1也直接参与对OPG的调节[16]，OPG水平方面酒制品作用最为显著。

4.2 狗脊各炮制品作用比较分析

本研究经上述分析及实验结果构建了IL-6TNF-α和IL-1Ca和P，OPG的一整条影响骨形成的信号通路，但也只是从炎性因子角度考虑的一条通路，并不完善，狗脊的不同炮制品对维甲酸致雄鼠骨质疏松症的作用效果体现在其中的各个环节，作用强弱不等，若按照s-TRAP水平的影响则各炮制品作用顺序为酒制品>砂烫品>蒸制品>生品>盐制品；若按照作用机制指标总评分则顺序为砂烫品>酒制品和盐制品>蒸制品>生品，可以归纳为酒狗脊和砂烫狗脊效果较好，而蒸狗脊、盐狗脊以及生狗脊作用次之。前两者分别为狗脊最早及明代前沿用炮制品和现今应用较为广泛的品种，而后三者则存在于古今炮制品演变过程中[17]，生品须炮制，炮制后作用增强，至于炮制方法的选择，本研究结果表明，加热方式中干热的砂烫法优于湿热的水蒸法，辅料中黄酒优于食盐。

前期实验中对狗脊各水煎液样品进行HPLC-DAD分析，选取254，280，365 nm 3个波长，其中254，365 nm为常用波长，280 nm为狗脊中指标性成分原儿茶酸和原儿茶醛的检测波长[18]，经实验结果对比发现254 nm波长下峰的数量较多，且原儿茶酸和原儿茶醛的色谱峰亦有体现，综合考虑，选取此波长作为狗脊各灌胃样品的分析波长。结合药效学实验结果，发现此图谱对于综合评分法匹配较好，对于s-TRAP指标水平并没有很好地匹配，而s-TRAP这一指标是体现影响破骨细胞活性的整体指标。作者认为此图谱反应的更多的是小分子酚酸类化合物的信息，此类化合物具有一定的抗炎作用[19-21]；然而影响破骨细胞的通路和环节不单单是炎性因子靶点，水煎液中糖类等组分变化情况并未在图谱中体现，其亦有可能是通过其他通路途径影响s-TRAP水平的物质基础。不难看出，狗脊各炮制品水煎液指纹图谱还有待深入研究，以更加全面地反应其药效和作用机制的物质基础信息。

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Study on decoction′s effect of different processed rhizomes of

Cibotium barometz on retinoic acid induced male rats osteoporosis

XU Gang 2， 3， SUN Na 2， 3， ZHAO Min-jie 2， 3， JU Cheng-guo 2， 3， JIA Tian-zhu 2， 3*

（1.School of Pharmacy Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；

2.Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province， Dalian 116600， China；

3.The Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstract] This study compared the decoction′s HPLC figures of the different processed rhizomes of Cibotium barometz including the raw， the sand-baked， the wined， the steamed and the salted， on the basis of which， with the sand-baked Drynaria fortunei decoction as the positive control group， comparingall groups′decoction， concentration of which was 104.2 g・L-1， for 4 weeks， by their effects （s-TRAP and total scores of OPG， Ca， P， IL-6， TNF-α and IL-1） on retinoic acid induced male rats osteoporosis. The experiment results showed the sand-baked and the wined were better than the steamed， the salted and the raw；in the processing methods′ selection， the sand-baked was a better heating method than the steamed and the rice wine was the better excipient than the salt. It provided a reference to explain the processing principle of rhizomes of C. barometz and work mechanism of anti-osteoporosis.

[Key words] Cibotium barometz； processed products； decoction； retinoic acid； osteoporosis； osteoclast

doi：10.4268/cjcmm20140611