双填料固相萃取高效液相色谱/质谱法同时检测腌菜中9种N亚硝胺

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摘要：亚硝胺是三大强致癌食品污染物之一，普遍存在于腌制和热加工食品中。本研究建立了一种基于液质联用技术结合多级反应监测模式扫描（MRM）检测N亚硝胺的新型固相萃取液相色谱方法，可以快速直接检测腌菜中9种N亚硝胺。实验优化了液相色谱分离与检测条件，同时考察了4种固相萃取单柱（碱性氧化铝Al2O3、C18、硅胶、硅藻土）和2种双填料的混合固相萃取柱（Al2O3C18， Al2O3硅胶）吸附解析的净化效果。结果表明，采用Al2O3C18混合柱纯化，液相色谱检测，外标法定量，对9种亚硝胺的回收率达75.7%～116.0%，检出限为0.20～0.49 mg/L。采用本方法检测不同产地的6类腌菜产品中亚硝胺含量，二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺的检出率相对较高，分别为37.5%和25.0%，其中二乙基亚硝胺在雪里蕻腌菜中最高含量达59.1 mg/L，亚硝基吗啉在所有样品中未检出。

关键词：N亚硝胺；液相色谱；质谱；双填料固相萃取；腌菜

1引言

N亚硝胺是世界公认的强致癌性食品污染物，在食品加工和贮藏过程中形成的亚硝胺是人体中亚硝胺的主要来源。腌制、油炸、烟熏、焙烤、饮用水等食品中均有检测出亚硝胺的报道[1～5]。毒理学实验证明，亚硝胺具有强大的细胞毒性、诱变性，可导致神经中毒、肾中毒、致畸，诱导肝、肺、肠、胃等癌变，严重威胁人体健康[6]。

腌制食品是含亚硝胺的代表性食品，传统的腌制工艺中由于其前体亚硝酸盐及胺类的广泛存在，或添加亚硝酸盐作为防腐剂和发色剂，大大增加了亚硝胺的生成概率，因此对亚硝胺的检测、控制亚硝胺的形成尤为重要[7，8]。目前，亚硝胺的测定主要通过水蒸汽蒸馏、液液萃取（LLE）、固液萃取法（SLE）提取[9～12]，气相色谱质谱（GCMS）[13，14]、气相热能分析仪（GCTEA）[15，16]、液相色谱（HPLC）[17～19]、气相色谱[20]、液相色谱质谱串联方法（HPLCMS）检测[21，22]。但是腌菜样品基质复杂，N亚硝胺含量相对较低，净化分离难、不稳定，常规检测方法存在分析程序复杂、检测种类少等缺点。目前对蔬菜类腌制食品中N亚硝胺类化合物的检测报道较少。

固相萃取技术可以高效、快速并大批量处理样品，不仅提高了分析质量和效率，减少有机溶剂使用量，节约成本，而且可以降低环境污染。Al2O3是一种常规无机萃取材料，稳定性好，吸附性强；C18作为一种高效有机型萃取材料，适用范围广，也常被应用于食品污染物检测分析的预处理[23]。本实验首先采用HPLC/MS结合MRM扫描对9种N亚硝胺进行定性分析，根据9种亚硝胺的不同分子极性特点并结合腌菜样品基质的复杂性研究单种填料和混合填料对亚硝胺的分离纯化效果。建立了双填料（Al2O3C18）混合固相萃取柱净化腌菜亚硝胺提取样品的新方法，经高效液相色谱分离检测，定量分析腌菜中的亚硝胺，取得了良好的实验结果。本方法简便、重现性好、实现了有机无机混合材料分离纯化复杂基质样品中的痕量亚硝胺，可用于普通实验室对不同食品中N亚硝胺的快速直接检测，为食品安全检测和评价提供实际参考依据。

2实验部分

2.1仪器与试剂

LTQXL超高效液相色谱质谱联用仪（美国Thermo公司），15252998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；VPODS C18 色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm，日本SHIMADZU公司）；R3旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；NEVAP氮吹仪（美国Organomation公司）；固相萃取装置（天津Auto Science公司）；MilliQ Integral超纯水机（美国Millipore公司）。

亚硝胺混合标准品（Nitrosamines，纯度>98%）、冰乙酸（色谱纯），均购自Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（色谱纯，国药公司）；固相萃取柱层析用C18（10 μm，美国Alltech公司）；Al2O3（100～200目，国药公司）；硅胶（200～300目，青岛海洋公司）；硅藻土（上海奉贤公司）。

2.2样品预处理

2.2.1样品提取从超市分别采购最新批次雪里蕻腌菜、酸豆角、腌萝卜干、榨菜、冬菜及红油豇豆，准确称取上述样品各10.0 g，加入20 mL纯水，浸提4 h，初滤后，低温真空旋蒸浓缩至5 mL，8000 r/min离心15 min，取上清液置于10 mL试管中，2 ℃冷藏保存。

2.2.2样品净化分别称取2.5 g Al2O3和C18，装填至85 mm×20 mm的固相萃取柱，用水、甲醇和正戊烷进行预处理，将提取的样液以2.0 mL/min流速过Al2O3C18固相萃取柱，用20 mL正戊烷淋洗除杂，20 mL甲醇以1.0 mL/min流速洗脱回收待测物质，收集洗脱液后经过低温真空旋转蒸发仪部分浓缩至1～2 mL，转移至浓缩瓶，通过氮吹仪浓缩至干，定容至1 mL。进样分析前溶液经过0.45 μm滤膜过滤。

2.3检测方法

2.3.1液相色谱条件进样量：10 μL；流速：0.8 mL/min；波长：230 nm；柱温：25 ℃；流动相：乙腈水，梯度洗脱：0～16 min，20%～100% 乙腈。