用液相色谱-PITC柱前衍生法对老酸奶中掺水解动物蛋白检测方法的研究

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摘　要】本文采用PITC柱前衍生法，利用液相色谱和氨基酸分析柱，对老酸奶中L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法的回收率在89.95%-92.16%之间，变异系数在4.33%-5.96%之间。本法具有检测结果准确，方法稳定性好，回收率高等优点，可用于老酸奶及乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。

【关键词】柱前衍生；老酸奶；L-羟脯氨酸；液相色谱

0.引言

最近一则关于“果冻，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上流传，因破皮鞋可以提炼出明胶。明胶是一种极为常见的食品添加剂，是从牛、猪等动物骨和皮中的胶原通过变性而制得的变性蛋白质，其化学组成与胶原基本相同，主要成分是胶原蛋白。老酸奶等乳制品为了保持其口感和外观，会适当添加明胶等食品添加剂，这是国家允许使用的。而皮革制成的明胶透明，无味，消费者根本无法区分。本文通过检测皮革水解蛋白来区分食用明胶和皮革制成的明胶。皮革水解蛋白多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进去的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有皮革水解蛋白的食物，金属铬离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，严重的会患上癌症。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中含有由废弃皮革而来的成分。

本文提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法，采用异硫氰酸苯酯pitc柱前衍生法，利用液相色谱和氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法检测结果准确，方法稳定性好，可用于老酸奶等乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。

1.材料与方法

1.1原理

样品经蛋白水解试剂水解，释放出L-羟脯氨酸，然后用异硫氰酸苯酯（PITC）衍生，采用液相色谱仪测定，外标法定量。

1.2仪器

液相色谱仪（附紫外检测器）；旋转蒸发仪；分析天平（感量0.1mg）；离心机；涡旋混合器；恒温水浴振荡器。

1.3试剂

1.3.1乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正己烷（分析纯）；L-羟脯氨酸标准品≥90%

1.3.2蛋白水解试剂：称取0.1g苯酚置于100mL容量瓶，加入50mL浓盐酸，加水定容至100mL。

1.3.3 0.1mol/LHCl水溶液：量取8.3mL浓盐酸，用纯水定容至1000mL。

1.3.4衍生剂PITC溶液：将250μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10mL。

1.3.5三乙胺溶液：将1.4mL三乙胺用乙腈定容至10mL。

1.3.6标准溶液储备液：称取一定量L-羟脯氨酸，用0.1mol/LHCl水溶液溶解，得到浓度为1mg/mL的储备溶液。

1.3.7标准溶液使用液：将储备液用0.1mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为10μg/mL的L-羟脯氨酸溶液。

1.4样品水解

称取奶粉0.1g或老酸奶0.5g（精确到0.1mg）,置于20mL蛋白水解瓶中（迪马公司生产），加入10mL蛋白水解试剂，旋紧盖子，振荡混匀，然后置110±1℃烘箱中水解24小时。水解完毕，用超纯水将水解液全部转移至蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。用0.1mol/L HCl水溶液分三次溶解残渣，定容至25mL容量瓶中，混匀,待衍生。

1.5样品衍生

准确量取200μL标准和样品水解溶液，分别置于2mL样品瓶中，各加入100μL三乙胺溶液和100μL衍生剂PITC溶液，混匀，室温放置1h，再分别加入400μL正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5～10s，静置分层，分别取下层溶液，经0.22μm针式过滤器过滤，待分析。

1.6测定

1.6.1分析条件

色谱柱：DiamonsilAAA250×4.6mm，5μm

流 速：1.0mL/min

检测器：UV254nm

柱 温：：45℃

进样量：10μL

流动相A：0.05mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH值为6.50±0.05）

流动相B：甲醇：乙腈:水=20:60：20

梯度程序

1.6.2测定

按仪器操作规程，依次注入标准工作溶液和样品处理液，将标准浓度，称样量和稀释体积输入计算机中，仪器测定结果后自动计算结果并打印。

2.结果与讨论

2.1添加回收结果及变异系数

表一　奶粉中添加回收结果及变异系数

表二　老酸奶中添加回收结果及变异系数

L-羟脯氨酸标准5μg/mL液相色谱图

奶粉中添加L-羟脯氨酸（添加水平5μg/mL）

的液相色谱图

老酸奶中添加L-羟脯氨酸

（添加水平5μg/mL）的液相色谱图

通过上述表格可以看出：奶粉和老酸奶通过加标测定，回收率均在89.95%-92.16%之间，回收效果很好，变异系数在4．33%-5．96%之间也在规定范围内。

2.2结论

根据上述实验可知：采用PITC柱前衍生法，利用液相色谱和氨基酸分析柱，对老酸奶及乳制品中L-羟脯氨酸进行分析检测。该方法具有检测结果准确，方法稳定性好，回收率高等优点，可用于老酸奶及乳制品中是否含有皮革成分的鉴别。

【参考文献】

［１］田艳玲，孙妍，陈婧，索娅．乳与乳制品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸测定法[J].中国乳品工业,2009,37(6):51-52．

［２］刘婷，姜金斗，刘宁．HPLC-OPA柱后衍生离子交换法对乳粉中掺水解动物蛋白检测方法的研究[J].食品工业科技，2007,(7): 207-209．