攀西地区蚕豆根瘤菌抗逆性研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇攀西地区蚕豆根瘤菌抗逆性研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：对采自四川省攀西地区8个县市14个采样点的22株蚕豆根瘤菌进行耐盐、耐酸碱、抗生素抗性和耐高温或低温等抗逆性测定，结果表明，供试菌株普遍耐盐性差，仅有4株菌株能在10 g/L NaCl上生长，其中2株菌株能在50 g/L NaCl上生长；供试菌株对酸碱的耐性比较强，所有菌株都能在pH 5.0～10.0范围内生长，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0范围内生长；对温度的适应范围较宽，63.6%的菌株既能耐受8 ℃低温，又能耐受60 ℃高温热激30 min；对抗生素的抗性表现为氨苄青霉素>氯霉素>红霉素>四环素>庆大霉素>卡那霉素。筛选出2株耐盐、耐酸碱、生长温度范围广和耐抗生素较强的菌株，分别为B1和B3。

关键词：蚕豆根瘤菌；抗逆性；攀西地区

中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）11-2516-03

攀西地区位于长江上游，处川西南地区、横断山脉系，属青藏高原、云贵高原向四川盆地的过渡带，地势西北高、东南低，相对高度5 653 m[1]。该地区光资源丰富，具有典型的南亚热带河谷气候特征和山区立体气候特点，境内不仅现有生物资源丰富，而且具有引种、培育热带和寒带多种动植物的条件[2]。

蚕豆是世界上重要的豆科作物，是中国重要的粮食、蔬菜、副食、饲料、绿肥和养地作物[3]。四川栽培蚕豆有2 000多年的历史，年种植蚕豆约30万hm2[4]，其中凉山、阿坝、甘孜三州生产的大白蚕豆品质好，部分产品以原粮出口创汇，是高原山区的主要增收作物[5]。蚕豆共生体——根瘤菌能够固定空气中的氮合成氨，供植物生长需要，但其共生固氮受到环境条件的限制[6，7]，并有研究指出，某种特殊根瘤菌群的出现与适当的宿主豆科植物、土壤温度、土壤酸碱度、土壤水分含量等有明显的相关性[8]。研究对攀西地区8个县市的14个采样点分离的22株蚕豆根瘤菌进行耐盐性、生长温度、生长pH范围以及对抗生素抗性的测定，为筛选适宜攀西地区环境的高效蚕豆根瘤菌及其遗传多样性的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

从四川省攀西地区8个县市14个采样点分离得到22株蚕豆根瘤菌，水培回接全部结瘤，供试菌株情况见表1。

1.2 抗逆性试验

1.2.1 耐盐性测定 在YMA培养基上进行供试菌株的活化培养，后接种于NaCl浓度分别为10、20、30、40和50 g/L的YMA培养基上，以含0.2 g/L NaCl的YMA培养基为对照，重复3次，28 ℃培养7 d观察记录，生长记为“+”，不生长记为“-”。

1.2.2 耐酸碱性测定 以pH 7的YMA培养基为基础培养基，用HCl或NaOH调节培养基pH分别为4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，然后将供试菌株接种于不同pH的培养基上，以pH 7.0的培养基为阳性对照，28 ℃培养7 d，观察及记录方法同1.2.1。

1.2.3 生长温度范围测定 将活化纯化的菌株接种于YMA培养基上，分别在8、28、37和60 ℃（其中，37 ℃和60 ℃是指在此温度下热激处理30 min后于28 ℃下培养）下培养7 d，以28 ℃为阳性对照，观察及记录方法同1.2.1。

1.2.4 抗生素抗性测定 选取氨苄青霉素（Amp）、庆大霉素（Gm）、红霉素（Em）、氯霉素（Cm）、四环素（Tc）和卡那霉素（Km）6种抗生素，每种抗生素终浓度分别设定为5、50、100、300 μg/mL 4个浓度梯度。每种抗生素经细菌过滤器过滤除菌后，加入到经高温灭菌处理后冷却至50 ℃左右的YMA培养基中，制成平板，以不加抗菌素的YMA平板为对照，培养观察及记录方法同1.2.1。

以上试验均采用点接种法，每个处理设置3次重复。

2 结果与分析

2.1 耐盐性测定结果

供试的蚕豆根瘤菌对NaCl的耐性普遍较差，81.8%的菌株不能在含10～50 g/L NaCl的培养基上生长，仅有4株菌株能在含10 g/L NaCl的培养基上生长，分别为B1、B2、B3和B15，其中菌株B1、B3还能在试验所设其他浓度（30～50 g/L）的含NaCl的培养基上生长，具有较好的耐盐性。比王庆等[9]测得的蚕豆根瘤菌的耐盐生长范围0.1～0.3 mol/L（5.8～17.6 g/L）广；刁治民等[10]对青海蚕豆根瘤菌进行耐盐回接试验表明，在营养液NaCl浓度为0.1 mol/L（5.8 g/L）时已经不结瘤；何恒斌等[11]对沙冬青根瘤菌进行的耐盐试验指出，在盐渍化滩地采集到的根瘤菌能耐受70 g/L的NaCl。不同菌株耐盐性差异可能与菌株生长的地理环境有关。

2.2 耐酸碱性测定结果

供试蚕豆根瘤菌对酸碱的耐性范围较广，不同的菌株对酸碱的耐性存在差异。试验结果表明，所有供试菌株均能够在pH 5.0～10.0的范围内生长；除B5不能在低pH（pH 4.0）下生长，B4、B11、B12、B16、B17不能在pH 11.0和pH 12.0下生长， B19不能在pH 12.0下生长外，其他菌株（占菌株总数的68.2%）均能在pH 4.0～12.0的范围内生长。

2.3 生长温度范围测定结果

温度是重要的生态因子之一，影响固氮酶活性，针对蚕豆根瘤菌生长温度范围的测定还少见报道。徐开未等[12]对金沙河谷区山蚂蝗属根瘤菌进行温度范围测定结果表明，在4 ℃也有根瘤菌生长。一般认为根瘤菌的最适生长温度为25～30 ℃，60 ℃高温下5 min会全部被杀死，只有极少数根瘤菌能生长在4 ℃的条件下[13]。此次试验供试蚕豆根瘤菌生长温度范围较广。有81.8%的菌株能在8 ℃的条件下生长，全部菌株能在37 ℃热激30 min处理后生长，77.3%的菌株能在60 ℃热激30 min处理后生长。其中，B2不能在低温（8 ℃）和高温（60 ℃）热激处理后生长，B4、B13、B16、B18不能在高温热激处理后生长，B7、B14、B17不能在低温条件下生长。由此可知，有63.6%的菌株既能耐受8 ℃的低温，又能耐受60 ℃的高温热激。试验菌株具有较广的生长温度范围可能与攀西地区南亚热带气候以及高山所形成的垂直气候分布有关。

2.4 抗生素抗性测定结果

2.4.1 卡那霉素 供试蚕豆根瘤菌对卡那霉素都很敏感，没有一株根瘤菌能在设定的最低浓度的卡那霉素平板上生长。

2.4.2 庆大霉素 供试蚕豆根瘤菌对庆大霉素的抗性强于卡那霉素。有27.3%的菌株能在浓度为50 μg/mL的庆大霉素平板上生长，18.2%的菌株能在100 μg/mL的庆大霉素平板上生长，有1株菌株能在300 μg/mL的庆大霉素平板上生长。其中，B4、B6能在5～50 μg/mL的庆大霉素平板上生长，B12、B16、B17能在5～100 μg/mL的庆大霉素平板上生长，B19能在试验所设的所有浓度（5～300 μg/mL）范围内生长，对庆大霉素抗性最强。

2.4.3 四环素 供试菌株对四环素耐受能力较差。除B4、B11、B12、B16、B17和B19外，其他所有菌株均能在低浓度（5 μg/mL）四环素平板上生长，占到72.7%；仅有1株根瘤菌（B3）能在试验所设的所有四环素浓度（5～300 μg/mL）范围内生长，对四环素表现出了较强的抗性。

2.4.4 红霉素 供试蚕豆根瘤菌对红霉素的抗性强于前3种抗菌素。全部根瘤菌均能在5 μg/mL的红霉素平板上生长，31.8%的菌株能在50 μg/mL红霉素的平板上生长，13.6%的菌株能耐受100 μg/mL的红霉素，仅1株菌株能耐受300 μg/mL的红霉素。其中，B1能在试验所设所有红霉素浓度（5～300 μg/mL）范围内生长，表现出了较强的抗性；B3、B15能在5～100 μg/mL的红霉素平板上生长；B7、B19、B20、B21能在5～50 μg/mL的红霉素平板上生长。

2.4.5 氯霉素 供试蚕豆菌株对氯霉素的抗性较强，所有菌株均能在5 μg/mL的氯霉素平板上生长，86.4%的菌株能在50 μg/mL的氯霉素平板上生长，72.7%的菌株能耐受100 μg/mL的氯霉素，仅1株菌株能耐受300 μg/mL的氯霉素。其中，B1、B12和B17耐受性较差，仅能在5 μg/mL氯霉素平板上生长；B2、B5和B20能在5～50 μg/mL的氯霉素下生长；B21能在试验所设所有氯霉素浓度（5～300 μg/mL）范围生长，耐受性最强；其他均能在5～100 μg/mL的氯霉素范围内生长。

2.4.6 氨苄青霉素 供试蚕豆根瘤菌对氨苄青霉素最不敏感，表现出了较强的抗性。所有供试菌株均能够在含5 μg/mL氨苄青霉素的平板上生长，95.5%的菌株（除B11外的所有菌株）能生长于含50 μg/mL氨苄青霉素的平板上，77.3%的菌株（除B4、B11、B12和B17外的菌株）能够耐受100 μg/mL的氨苄青霉素，在含300 μg/mL氨苄青霉素的平板上仍然有72.7%的菌株（另除B16外的菌株）能够生长。B11对氨苄青霉素最敏感。

综上可知，供试蚕豆根瘤菌对抗生素的抗性普遍表现为氨苄青霉素>氯霉素>红霉素>四环素>庆大霉素>卡那霉素，不同的菌株有不同的抗性，同一菌株对不同抗生素的抗性不同，对同一种抗生素，随着浓度的增大抗性也越来越弱。此结果与徐开未等[14]、何恒斌等[11]的研究结果相一致。根瘤菌对抗菌素的抗性可以作为分群的指标之一。韦革宏等[15]对河南省采集的根瘤菌进行的抗菌素抗性试验发现，在低浓度的抗生素中大多数根瘤菌都能生长，在300 μg/mL的红霉素、卡那霉素、庆大霉素中没有1株根瘤菌生长，仅有7株根瘤菌能在300 μg/mL的青霉素中生长。韦革宏等[16]对山东省根瘤菌抗菌素抗性研究结果表明，32%的菌株对300 μg/mL的青霉素具有耐性。可见，来自不同地理环境的根瘤菌对抗菌素的抗性存在差异。研究筛选出了针对不同抗菌素有较强抗性的菌株， B1、B3、B19、B21分别能在300 μg/mL的红霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素上生长，表现出了较强的抗性。

3 小结

对采自攀西地区8个县市14个采样点经水培验证的22株蚕豆根瘤菌的4项抗逆性指标进行分析后得出，菌株对盐的耐性普遍较差，只有4株（B1、B2、B3、B15）菌株能在含10 g/L NaCl的培养基中生长，但仍有2株菌株（B1、B3）能在高浓度（50 g/L）NaCl条件下生长。菌株具有较强的耐酸碱性，所有菌株都能在pH 5.0～10.0的范围内生长，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0的范围内生长。对于温度的耐性也比较强，有63.6%的菌株能耐受8 ℃的低温和60 ℃的高温热激（热激30 min），可能是与该地区特殊的气候条件有关。对抗生素的抗性表现为氨苄青霉素>氯霉素>红霉素>四环素>庆大霉素>卡那霉素，除卡那霉素外，均筛选出了能抗高浓度（300 μg/mL）抗生素的菌株。

所有的菌株中，B1、B3能耐受高浓度（50 g/L）的NaCl，能在pH 4.0～12.0范围内生长，能耐受8 ℃的低温和60 ℃的高温热激，B1菌株能够在含300 μg/mL红霉素的平板上生长，B3菌株能在300 μg/mL四环素条件下生长。因此，这2株菌株为筛选出来的抗逆性较强的优良菌株。

参考文献：

[1] 方一平，苏春江，徐 云.攀西自然资源的空间特征与生物资源开局[J].山地学报，2004，22（增刊）：46-53.

[2] 罗忠新.攀西地区农业气候资源开发利用途径[J].四川气象，1997（2）：41-43.

[3] 叶 茵.中国蚕豆学[M].北京：中国农业出版社，2003.

[4] 杨武云，余东梅，罗菊枝. 四川蚕豆育种及生产现状[J]. 四川农业科技，2003，13（10）：14.

[5] 苏 旺.西部特色杂粮产业发展的SWOT分析[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2010.

[6] 李友国，周俊初.影响根瘤菌共生固氮效率的主要因素及遗传改造[J].微生物学通报，2002，29（6）：86-89.

[7] 陈文新，汪恩涛，陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系[J].中国农业科学，2004，37（1）：81-86.

[8] WOOMER P， SINGLETON P W， BOHLOOL B B. Ecological indicators of native rhizobia in tropical soils [J]. Appl Environ Microbial，1988，54（5）：1112-1116.

[9] 王 庆，方 平.蚕豆根瘤菌的分离及生物学特性研究[J].涪陵师范学院学报，2004，20（5）：89-90.

[10] 刁治民，王得贤，张学功.青海豌豆与蚕豆根瘤菌的初步研究[J].青海农林科技，1996（1）：11-15.

[11] 何恒斌，贾昆峰，贾桂霞，等.沙冬青根瘤菌的抗逆性[J].植物生态学报，2006，30（1）：140-146.

[12] 徐开未，张小平，陈远学，等.金沙干热河谷区山蚂蝗属根瘤菌抗逆性研究[J].安徽农业科学，2009，37（2）：501-503.

[13] 关桂兰，王卫卫，杨玉锁.新疆干旱地区固氮生物资源[M].北京：科学出版社，1991.

[14] 徐开未，张小平，陈远学，等.攀枝花市相思树根瘤菌的抗逆性研究[J]. 北方园艺，2009（6）：165-168.

[15] 韦革宏，刘虎岐，孙科技，等. 河南省豆科植物根瘤菌表型多样性研究[J].西北农林科技大学学报，2002，30（3）：71-75.

[16] 韦革宏，郝鲜俊，孙科技，等.山东省根瘤菌表型多样性及数值分析[J].生物多样性，2002，10（2）：208-212.