浅析乳制品中三聚氰胺检测能力验证

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摘要：本文要以国家认监委组织的三聚氰胺能力验证为契机。以岛津液相LC-10A配紫外检测器为例,以离子对试剂缓冲液/乙腈水溶液为流动相,通过改变流动相的配比, 从而调节该物质的最佳分离度，优化仪器条件，来提高工作效率。并对乳制品样品的前处理方法进行探讨和改进.

关键词：乳制品 三聚氰胺 检测 高效液相色谱 离子对试剂 加标回收率 探讨

引言：三鹿奶粉事件发生以来，三聚氰胺检测工作量急剧增加，检测要求越来越高。为了验证检测实验室的检测技术能力，强化检测实验室监督管理，国家认证认可监督管理委员会于2008年10月中旬开展了这次能力验证活动。在此次能力验证活动中，阿克苏地区质量与计量检测所的“乳品中三聚氰胺检测”能力验证项目获得“满意”结果，表明该所三聚氰胺的检测能力符合国家有关要求，能够完全满足三聚氰胺检测的需要。就本次能力验证采用高效液相色谱法做一些实验探讨。

三聚氰胺（化学式：C3H6N6）呈弱碱性，能溶于甲醛、乙酸等，微溶于水和醇，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺可用于生产食品包装材料、农药和化肥，可能从环境、食品包装材料等途径进入到食品中，在产品中检出微量属于正常。三聚氰胺的含氮量为66％左右，常被不法商人添加到食品中，以提升检测中蛋白质的含量指标。

一：原 理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

仪器与试剂

仪器 岛津高效液相色谱仪LC-10A、电子分析天平（感量为0.0001g）、电子天平（感量为0.01g）、离心机、超声波清洗器、旋涡混合器、固相萃取装置、氮吹仪、真空泵、50 mL具塞塑料离心管等。

试剂与材料 试验用水均符合GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》一级水；甲醇、乙腈（色谱纯）；氨水、柠檬酸（优级纯）；辛烷磺酸钠：纯度大于98.0%；50％甲醇水溶液；1％三氯乙酸溶液；5％氨化甲醇溶液；离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L 备用；三聚氰胺标准品：纯度大于99.0%；1 mg/mL的三聚氰胺标准储备液（用1+1甲醇-水溶液溶解定容）；阳离子交换固相萃取柱：临用前依次用3 mL甲醇和5 mL 水活化；微孔滤膜：0.2μm，有机相；氮气：纯度大于99.999%等。

二：仪器工作条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（大连中汇达科学仪器有限公司） ；流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；波长：240 nm ；进样量：20 μL。

三： 分析方法

1．标准曲线的绘制 用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为

0.5、 1、2、4、8、16 μg/mL 的标准工作液，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

2．样品的测定

提取 称取2 g（精确至0.0001 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。

净化 将上一步骤中的待净化液转移至固相萃取柱（Strata -X 系列SPE小柱，临用前已经活化）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL5%的氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于40℃下用氮气吹近干，用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

实验结果

1．LC-10A高效液相色谱仪所测三聚氰胺标准曲线结果。三聚氰胺标准系列浓度为0.5、 1、2、4、8、16 μg/mL ，三聚氰胺峰面积为36965，74270，148093，292119，583420，1180109，相关系数R=0.999959。

2、加标回收率试验。在不含三聚氰胺的奶样中分别加入浓度为2.0和8.0 μg/mL的三聚氰胺标准溶液，测得加标后的样品浓度和为1.85和7.80 μg/mL, 三聚氰胺回收

率为92.5%和97.5%，得到了很好的回收率。

四、结果讨论

1．离子对试剂缓冲液选择。离子对试剂选择庚烷磺酸钠要优于辛烷磺酸钠。一般来说，碳链短的比碳链长的分离度要好，而且碳链越长，离子对试剂和柱子的平衡时间越长，柱子越不易冲洗，对柱子损害越大。

2．离子对试剂缓冲液pH值的选择。C18柱使用的缓冲液pH值范围在2～9.5之间，太高的pH值，会使色谱柱硅胶溶解，太低的pH值，会使色谱柱键合的烷基脱落。所以离子对试剂缓冲液pH值选择3.0 。

3．流动相比例的选择。流动相（离子对试剂缓冲液和乙腈）的比例应根据仪器和选择的色谱柱作相应的调整，以达到最好的色谱分离。原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间，以便更好地分离杂质和目标物。乙腈含量一般控制在10%左右，乙腈比例越大，出峰时间越快。

五．注意事项。

1、样品为奶粉，在称取样品后，用三氯乙酸溶液将奶粉彻底溶开后再加入5mL乙腈，混匀后再通过超声提取蛋白质。为提取彻底，可以适当延长超声提取的时间。

2、离心机转速最好不低于8000 r/min，否则离心效果差，影响过滤效果。

3、固相萃取柱在临净化前，一定要先活化，过柱时不能等流干之后再加溶剂，防止气泡进入，影响净化和萃取效果；控制整个萃取过程流速稳定且不得超过1mL/min（一般控制在25滴/分），否则影响去除杂质和洗脱三聚氰胺的效果。

4、仪器的平衡：因为流动相中添加了一定量的离子对试剂，大概需要3h～5h仪器才能达到稳定的状态。

5、分离：选择合适的流动相比例，原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间，以便更好地分离杂质和目标物。

6、当检出阳性样品的峰不规则时，应认真判断是否是杂峰或是与杂峰重叠和污染。方法是从样品瓶中转移出一部分样液，加标后再进针判断，或与有质谱的实验室进行比对。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家标准，原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 （GB/T 22388-2008），北京：中国标准出版社，2008

[2] 张晓彤，云自厚。 液相色谱检测方法 [M] 北京：化学工业出版社 2000

[3] 于世林。 高效液相色谱方法及应用 [M] 北京：化学工业出版社 2000

[4] 中华人民共和国国家标准，分析实验室用水规格和试验方法 （GB/T 6682-2008），北京：中国标准出版社，2008