铜绿假单胞菌肺炎大鼠血浆内毒素与肺组织白细胞介素1和肿瘤坏死因子的关系

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[摘要] 目的 探讨铜绿假单胞菌肺炎中内毒素血症与白介素1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF）的关系。 方法 21只BALB/c小鼠随机分成3组，建立小鼠铜绿假单胞菌感染模型，以小剂量多黏菌素B拮抗内毒素活性，观察各组小鼠血浆内毒素水平、肺组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA水平。 结果 铜绿假单胞菌感染组小鼠24 h后血浆内毒素水平[（71.2±9.9）EU/mL]明显高于铜绿假单胞菌感染+多黏菌素B组[（50.5±10.8）EU/mL]（P < 0.01）；铜绿假单胞菌感染组小鼠24 h后肺组织中IL-1β mRNA水平[（0.89±0.06）]明显高于铜绿假单胞菌感染+多黏菌素B组[（0.64±0.07）]（P < 0.01）；TNFα mRNA水平[（0.61±0.07）]也明显高于铜绿假单胞菌感染+多黏菌素B组[（0.43±0.06）] （P < 0.01）。小鼠血浆内毒素水平与肺组织中IL-1β、TNFα含量有显著的相关性（r = 0.98，P < 0.01；r = 0.97，P < 0.01）。 结论 小鼠铜绿假单胞菌肺部感染内毒素血症与IL-1β、TNF-α显著相关。

[关键词] 铜绿假单胞菌；白介素1；肿瘤坏死因子；内毒素

[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0055-03

铜绿假单胞菌是医院内肺炎的一种主要致病菌，是最常见的多重耐药的革兰阴性菌。铜绿假单胞菌引起的呼吸道感染主要见于呼吸道免疫防御功能或全身防御功能受损害的患者，具有很高的治疗失败率和病死率[1]，研究其致病机制并采取相应对策已成为临床的迫切需要。近来人们发现内毒素、IL-1、TNF在其中起重要作用[2]，然而在铜绿假单胞菌肺炎中内毒素与IL-1、肿瘤坏死因子的关系尚不明确[2-4]。本实验试图探讨内毒素与IL-1、TNF在铜绿假单胞菌肺炎发病中的关系，有助于临床上采取相应的对策治疗铜绿假单胞菌感染。

1 材料与方法

1.1 实验材料

动物：SPF级BALB/c小鼠，4～6周龄，雌性，18～25 g，购于广东省医学实验动物中心；铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853由中山大学提供；多黏菌素B购自Sigma公司；IL-1β测定试剂盒购自MBI公司；TNFα测定试剂盒购自MBI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组情况 SPF级BALB/c小鼠共21只，随机分成3组，每组7只，分别为正常对照组，铜绿假单胞菌感染组（感染组），铜绿假单胞菌感染+多黏菌素B组（感染+多黏菌素B组）。

1.2.2 动物模型 实验前1 d铜绿假单胞菌以划线法接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基中过夜培养，用生理盐水配成菌液浓度为2×107 cfu/mL，小鼠注入量为1×107 cfu/只；多黏菌素B以蒸馏水配成1×103 U/mL溶液，过滤除菌后于4℃冰箱中保存，小鼠注入量为100 U/只，此剂量可使其血药浓度小于最小抑菌浓度而保留拮抗内毒素的作用，用苯巴比妥钠麻醉小鼠（70 mg/kg），感染前1 h静脉注入多黏菌素B、或生理盐水，然后气管内注入铜绿假单胞菌。

1.2.3 内毒素测定 采用动态浊度法定量测定，小鼠感染24 h后乙醚麻醉下经眼部采血0.5 mL，并以1200 r/min速度离心70 min，上层血浆稀释后于75℃水浴加热10 min，然于反应管中加入0.1 mL鲎试剂，0.1 mL内毒素标准液或样品，插入检测仪的反应孔中，于405 nm处测出透光度95%时的反应时间。

1.2.4 IL-1β mRNA、TNF-α mRNA测定 肺组织总RNA 的提取、定量及PCR产物的检测按MBI公司试剂盒提供的方法进行操作。实验所用引物TNF-S：5′-GCGGTGCCTATGTCTCA-3′；TNF-A：5′-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTA-3′；GAPDH-S：5′-CAACGGCACAGTCAAGG-3′；GAPDH-A：5′-AAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3′；IL1-S：5′-TTGACGGACCCCAAAAGATG-3′；IL-1-A：5′-AGAAGGTGCTCATGTCCTCA-3′。以上引物全部由上海生工生物工程公司合成。

1.3 统计学方法

本实验使用SPSS 20.0统计软件，正态分布的计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，相关性分析采用直线相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血浆内毒素水平的比较

笔者比较了各组小鼠的血浆内毒素水平，发现铜绿假单胞菌感染组24 h后血浆内毒素水平明显高于正常对照组（P < 0.01），而加入多黏菌素B后可明显降低感染小鼠的血浆内毒素水平（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组小鼠肺组织中IL-1β mRNA表达

笔者发现铜绿假单胞菌感染组24 h后小鼠肺组织中IL-1β mRNA水平明显高于正常对照组（P < 0.01），而加入多黏菌素B 可明显降低感染组小鼠肺组织IL-1β mRNA水平（P < 0.01）。见表2。

2.3 各组小鼠肺组织中TNF-α mRNA表达

笔者比较了各组小鼠肺组织中TNF-α水平，发现铜绿假单胞菌感染组24 h后小鼠肺组织中TNFα mRNA水平明显高于正常对照组（P < 0.01），而加入多黏菌素B 可明显降低感染组小鼠肺组织TNFα mRNA水平（P < 0.01），见表3。

2.4 小鼠血浆内毒素水平与肺组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA水平的相关性

笔者发现小鼠血浆内毒素水平与肺组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA有显著的相关性（r = 0.98，P < 0.01；r = 0.97，P < 0.01）。

3 讨论

铜绿假单胞菌肺部感染病情重，病死率较高，对多种抗菌素耐药，治疗困难。近来人们发现内毒素、IL-1、TNF可能在其中起重要作用，然而有关机制尚不清楚[2-4]。内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖，具有多种生物学活性，可以引起肺组织的炎症改变及肺功能的下降[5]，其机理通常先是激活单核巨噬细胞系统，诱导其分泌多种介质分子，然后通过这些介质分子在局部或循环中播散到机体其他部分而发挥效应，其中IL-1、TNF与感染性疾病关系最密切[6]。应用内毒素、IL-1、TNF拮抗剂可能会减轻肺部炎症，改善病情[7-9]。多黏菌素B是一种环状阳离子多肽类抗生素，能与内毒素的脂类A结合，从而抑制内毒素的活性，然而其肾脏及肝脏毒性限制了它的临床应用，后来人们发现小剂量多黏菌素B能降低烧伤患者的血将浆内毒素水平，而无肝肾毒性[10]。本实验显示铜绿假单胞菌感染小鼠24 h后血浆内毒素含量明显高于正常对照组，而加入小剂量多黏菌素B可以明显降低血浆内毒素含量。另外笔者发现铜绿假单胞菌感染组小鼠肺组织中24 h后IL-1β mRNA水平明显高于正常对照组（P < 0.01），加入多黏菌素B 可明显降低感染组小鼠肺组织IL-1β mRNA水平（P < 0.01），而且铜绿假单胞菌感染组小鼠肺组织中24 h后TNFα mRNA水平也明显高于正常对照组（P < 0.01），加入多黏菌素B 也可明显降低感染组小鼠肺组织TNF-α mRNA水平（P < 0.01），推测小剂量多黏菌素B可通过中和小鼠血浆内毒素进而降低肺组织中IL-1β mRNA水平和TNF-α mRNA水平。提示铜绿假单胞感染小鼠血浆内毒素水平与肺组织中IL-1β mRNA水平和TNF-α mRNA水平可能存在相关性。最后本研究采用相关分析法进一步证实它们之间确实有这种相关性（r = 0.98，P < 0.01；r = 0.97，P < 0.01）。据此，笔者认为在铜绿假单胞菌肺部感染中内毒素、IL-1、TNF起重要作用，可加剧病情恶化，通过选用内毒素拮抗剂或其他药物中和血浆内毒素水平，进而降低肺组织中IL-1、TNF水平，这样可以减轻病情。

[参考文献]

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[10] Andrew M，Calvin B. Reversal of postburn immunosuppression with low-dose polymyxin B [J]. J Trauma，1986，26（11）：995-998.

（收稿日期：2013-02-01 本文编辑：郝明明）