一起沙门菌爆发的菌株鉴定和分子溯源研究
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摘要：[目的]1起沙门菌爆发的菌株鉴定和分子溯源研究。[方法]收集2007年上海市黄浦区1起食源性沙门菌爆发病例的菌株，使用3种不同产地沙门菌分型血清进行菌株比对鉴定，测试菌株耐药性并对部分菌株进行多位点基因序列分型(MIST)。通过Pluse Net China非伤寒沙门菌数据库聚类分析上海市与重庆市爆发菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱。[结果]发生在上海市黄浦区某工地爆发的1起食源性菌株，经血清学和MIST鉴定为汤卜逊沙门菌ST 26型；菌株对6种抗生素(四环素、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺异恶唑)的耐药率均为100％。2007年重庆市报告多起食源性爆发案例中的C群沙门菌，经鉴定亦为汤卜逊沙门菌ST 26型，与上海市的菌株间存在高度遗传同源性。[结论]兰州生物制品研究所和泰国S&A的沙门菌分型血清的H因子“c”和“k”间存在交叉凝集。2007年上海市黄浦区发生的食源性爆发病例可能为输入性汤卜逊沙门菌ST26型的多重耐药克隆株引起。
关键词：C群沙门菌；鉴别诊断；交叉凝集；分子分型；爆发；多重耐药
中图分类号：R516.3 文献标志码：A
上海市黄浦区疾病预防控制中心作为上海市4个监测点之一，于2007年加入全球沙门菌监测网络(GSS)，现更名为全球食源性感染性疾病监测网(GFN)。实验室按照方案要求配置泰国产沙门菌分型血清对监测点医院定期送检的沙门菌腹泻病例菌株进行血清学复核。2007年10月，黄浦区中心医院连续报告5例以上疑为同一血清型的沙门菌腹泻病例，实验室初步鉴定为猪霍乱沙门菌，高度怀疑为聚集性病例，黄浦区疾病预防控制中心现场人员随即对病例进行流行病学调查。爆发菌株经我们使用泰国产沙门菌分型血清和丹麦SSI分型血清对菌株作分型比对、耐药分析和脉冲凝胶电泳(PFGE)等表型与分子型的综合分析后，最终确定引发此次食源性爆发的病原菌是汤卜逊沙门菌。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验菌株 2007年上海市GSS监测的18株汤卜逊沙门菌(包括黄浦区中心医院分离的8株汤卜逊沙门菌爆发菌株和1株分离自市售猪肚的汤卜逊沙门菌)；大肠埃希菌ATCC25922为药敏试验质控菌株；布伦登卢普沙门菌H9812作为PFGE的分子量标准菌株；国内参考株丙型副伤寒沙门菌(CNCC50017-156)、猪霍乱沙门菌(CNCC50018-5)、猪霍乱孔成道夫变种沙门菌(CNCC50732)均来自上海市疾病预防控制中心菌种保藏室。
1.1.2 培养基 亚硒酸盐煌绿增菌液(SBG)、罗伯特增菌液(RVS)、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂平板(XLD)、CHROMagar(tm)沙门菌显色琼脂平板(CAS)、水解酪蛋白琼脂平版(M-H)、H相诱导软琼脂平板来自上海科玛嘉科技有限公司；肠道双支糖综合鉴别管和其他辅助生化鉴定试剂由本中心供应室配置。以上增菌液和平板均避光10℃以下保存，在有效期内使用。
1.1.3 试剂和仪器 血清有沙门菌分型诊断血清50种(兰州生物制品研究所)、沙门菌分型诊断血清79种(S&A，Ltd，泰国)、沙门菌分型血清118种(SSI，丹麦)；抗生素纸片包括四环素(TET)、头孢噻呋(EFT)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氨苄西林(AMP)、复方磺胺甲嗯唑(SXT)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(CN)、链霉素(S)、磺胺异恶唑(s3)、甲氧苄氨嘧啶(W)(Oxoid，英国)16种；另有药敏分配器，VitekAM-60自动生化鉴定仪(生物梅里埃，法国)和菌液比浊仪(西门子，德国)；限制性内切酶Xba I(TaKaRa，日本)；SeaKem Gold琼脂糖(Cambraex Bio Rockland，美国)；脉冲凝胶电泳仪CHEF mapper system和凝胶成像系统GEL Doc 2000(Bio-Rad，美国)。血清和抗生素纸片均在有效期内使用。
1.2 方法
1.2.1 GSS监测 爆发病例调查按照《上海市沙门菌病监测方案2007年》中的定义和流行病学调查程序进行。
1.2.2 菌株鉴定 8株爆发菌株由临床实验室使用兰州生物所的沙门菌分型血清作初步鉴定后，送辖区疾病预防控制中心实验室使用泰国S&A沙门菌分型血清复核鉴定，结果存疑者由市疾病预防控制中心实验室用丹麦SSI沙门菌分型血清确认。玻片凝集属于直接抗原抗体反应的定性试验，根据抗原抗体产生凝集颗粒的程度进行分级。+：菌体抗原凝集颗粒细，背景浑浊不清；++：菌体抗原凝集颗粒较粗实，背景浑浊；+++：反应过程快，菌体抗原凝集颗粒细而均匀，背景较清；#：反应过程快，菌体抗原凝集颗粒粗实，背景清亮。
1.2.3 抗生素敏感性试验 参照美国临床实验室标准研究所(CLSI，2007年版)的操作规程采用改良K-B法，根据抑菌圈直径判断敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。头孢噻呋(EFT)K-B法的判断结果为19≤20～23 1≥24mm(由Oxoid公司提供参考值)。
1.2.4 多位点基因序列分析MIST分型(ST型) 挑选5株汤卜逊沙门菌，在中国疾病预防控制中心国家肠道病重点实验室测定沙门菌基因组上的7个管家基因(thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN)的部分片段，完成多位点测序后输入数据库分型。
1.2.5 PFGE和数据库根据GSS监测方案要求，将上海市2007年分离的18株汤卜逊沙门菌，在中国疾病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室按照Pulse Net规定的PFGE标准方法，获得脉冲场凝胶电泳图谱，使用Bio Numerics(Version 4.0)软件进行聚类分析，并通过国家传染病预防控制国家重点实验室非伤寒沙门菌图谱数据库(Pluse Net China)比对上海市汤卜逊爆发菌株与重庆市C群沙门菌爆发菌株的分子图谱。
2 结果
2.1 菌株来源
黄浦区中心医院2007年10月报告同一菌型沙门菌腹泻病人均来自黄浦区制造局路193号南联工地。该工地共有建筑工人百余人，均为浙江绍兴来沪务工人员，饮水为自来水，住宿为简屋房，共有2层，约300m2，12人/间。旁边为白搭厨房以及用餐点。经流行病学调查核实，2007年10月4日―13日共发现11人腹泻，男性6名，女性5名。患者发病时间为5日2人，9日3人，11日1人，13日3人。临床症状表现均有腹泻症状，稀便；发热4人，呕吐5人。发病后主动就诊，其中8人分离出沙门菌(经最终确认为汤卜逊沙门菌)。发病者有明显的
可疑食物及共同进餐史。调查中未能获取可疑污染食品，现场经环境消毒等措施处置后，未见后续病例。
2.2 菌株确认
黄浦区中心医院实验室分离的8株爆发菌株经兰州生物制品研究所的沙门菌分型血清初步鉴定为猪霍乱沙门菌，后经区疾病预防控制中心使用泰国S&A血清复核后发现存在H相位的“c”和“k”，因子间的交叉凝集现象，多数菌株可以根据交叉凝集结果的强弱初步判断为汤卜逊沙门菌。用丹麦SSI血清比对8株爆发菌株均与“k”因子呈特异性凝集而“c”因子不凝集，最终确认为汤卜逊沙门菌。
2.3 国内参考株的血清学比对和ST分型
国内参考株丙型副伤寒沙门菌(CNCC 50017-156)的ST型为146，目前在沙门菌MLST数据库中，该ST型菌株均为丙型副伤寒沙门菌；国内参考株猪霍乱沙门菌(CNCC50018-5)为ST 139，数据库中该型也均为猪霍乱沙门菌；国内参考株猪霍乱孔成道夫变种沙门菌(CNCC 50732)的sT型为145，数据库显示该sT型菌株为猪霍乱孔成道夫变种沙门菌或猪霍乱沙门菌；5株爆发菌株ST型均为26，MLST数据库显示，该型菌株均为汤卜逊沙门菌。MLST结果与丹麦SSI血清分型结果完全一致(表1)。
2.4 菌株耐药性
8株爆发株对14种抗生素的耐药谱完全一致，其中对四环素、阿莫西彬克拉维酸、氨苄西林、氯霉素、萘啶酸均100％耐药。
2.5 PFGE分型
上海市的18株汤卜逊沙门菌经Xba I酶切的电泳图谱完全一致，属于同一遗传克隆。通过中国疾病预防控制中心国家非伤寒沙门菌图谱数据库(Pluse Net China)，聚类分析上海汤卜逊爆发菌株与重庆市C群沙门菌菌株的图谱，两地菌株的图谱均符合爆发菌株的典型特征，重庆的爆发菌株间有90％的遗传同源性，与上海爆发菌株间有85％的遗传同源性；上海1株汤卜逊食源菌株与爆发菌株存在70％的遗传同源性，1株散发病例菌株与重庆爆发菌株间有95％的遗传同源性(图1)。
3 讨论
由于8株汤卜逊沙门菌爆发菌株的最后确诊，使汤卜逊沙门菌列上海市2007年非伤寒沙门菌l临床腹泻病例的第3位。分析诊断初始被误报为猪霍乱沙门菌的原因：①仅有1个H因子的差异，由于国产分型血清“k”与“c”因子间存在的交叉凝集，且“c”因子一旦“先入为主”后，很容易产生猪霍乱沙门菌的结论。②技术人员缺少对沙门菌主要菌型致病理论的认知是产生错误的次要因素，除伤寒沙门菌外，甲型副伤寒和猪霍乱沙门菌也属临床常见的侵袭性(菌血症)沙门菌，血培养多见，肠道罕见。由3种沙门菌分型血清的现场比对说明，沙门菌分型血清的优劣是除操作者自身使用技能以外的另一个对结果准确性有重要影响的客观因素之一。类似的混淆问题发生在早些时候(2007年7―9月，重庆市)报告数起丙型副伤寒沙门菌引起食源性爆发的诊断中。当地疾病预防控制中心的结论因未检测到相应Vi基因而被中国疾病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室否定，后经泰国S&A、丹麦SSI血清和MLST鉴定亦为汤卜逊沙门菌ST26型。
C群沙门菌中有多个血清型因抗原式相同导致难以鉴别，本次研究发现的确存在猪霍乱与汤卜逊沙门菌、丙型副伤寒与汤卜逊沙门菌之间的多重混淆。对此，技术人员除依赖高质量的诊断血清及科学严谨的因子鉴定流程外，还要辅以某些特殊生化反应。丙型副伤寒沙门菌Vi抗原有不稳定性，即Vi为阴性也无法排除丙型副伤寒沙门菌，必须对Vi进行多次诱导后方可排除丙型副伤寒沙门菌，有条件者可用PCR方法检测Vi基因，这样就不会将猪霍乱沙门菌(包括猪霍乱孔成道夫变种和得揆忒变种)误判成丙型副伤寒沙门菌。其次单纯的血清分型无法鉴别猪霍乱、猪霍乱孔成道夫变种以及猪霍乱得揆忒变种3种沙门菌血清型，简易生化试验能够鉴别(见表2)，前提是因子的鉴定须正确。类似的情况也存在乙型副伤寒与爪哇沙门菌的鉴定中。两者抗原式完全相同，仅靠酒石酸盐反应即可甄别：爪哇沙门菌阳性而乙型副伤寒沙门菌为阴性。但最终报告在法定传染病疫情管理中的意义却显著不同，乙型副伤寒沙门菌可引起类伤寒样症状，属国家乙类报告和管理传染病，而爪哇沙门菌导致的肠炎属丙类报告传染病。由此表明，正确的血清型鉴定结果能体现肠道传染病早期防控的科学价值。
基于基因组差异的分子分型技术已得到越来越多的应用。在本研究中，我们利用Pluse Net China数据库将上海爆发菌株与重庆的“丙型副伤寒”沙门菌爆发菌株的图谱进行聚类对比，并使用多位点基因序列分型(MIST)，最终确认不同时间、不同空间的病例菌株同属汤卜逊沙门菌克隆株。因存在高度遗传同源性，使我们有理由怀疑该ST 26型克隆株存在外源性输入的流行病学特征。
早期国外开展的沙门菌监测不太强调临床实验室对沙门菌的分型能力，而GSS项目开始转变这种依靠公共卫生实验室诊断沙门菌的模式。开始逐步推广到哨点的临床实验室。这种循序渐进的方式值得国内即将建立的沙门菌监测体系借鉴，更为重要的是，此能力建设需要得到临床实验室在技术与管理体系上的重视并加大投入。因此，我们建议临床实验室与辖区疾病预防控制中心实验室之间合理互补、优化配置沙门菌的分型血清，共享血清鉴定程序，避免误判现象。
1999年3月6―31日，美国加洲曾发生因食用被污染的鲜香菜造成76人汤卜逊沙门菌感染发病(其中35人的流调特征属散发病例)；2000年8月，美国加洲南部出现持续增多的汤卜逊沙门菌腹泻病例，最后确认源于1名隐性感染的食品从业人员不断加工生产的“带菌”面包。以上信息充分说明正确的沙门菌血清分型是沙门菌感染流行病学分析、分子分型的先决条件，我国已开始较大范围的沙门菌监测，必将发现更多公共卫生新问题，所以要求实验室严格诊断血清的质量控制和鉴定程序，准确的分型结果可促进对沙门菌病的溯源调查和科学防控。