碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖涂膜剂的制备及含量测定

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[摘要] 目的 研制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）壳聚糖涂膜剂并建立其含量测定方法。 方法 采用壳聚糖为主要辅料制备涂膜剂，用二奎琳甲酸试剂盒测定制剂中bFGF的含量，并进行皮肤刺激性实验。 结果 制备的涂膜剂中bFGF检测浓度线性范围为1～25 μg/mL（r = 0.999 7），平均回收率为100.4%，RSD值为1.15%（n = 5）。结论 该制剂制备工艺简单，含量控制准确，无皮肤刺激性。

[关键词] 碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖涂膜剂；含量测定；二奎琳甲酸法

[中图分类号] R943 [文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2013）01（c）-0161-02

创伤愈合障碍是临床常见的难题，如何缩短愈合时间、提高愈合质量，理想的创面用药至关重要[1]。随着分子生物学的发展，多种细胞生长因子在组织修复及炎症中的作用机制已经明确。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是体内重要的促进创伤愈合的细胞因子之一，对皮肤、血管和神经的再生具有较好的促进作用[2-3]。壳聚糖是一种天然的聚阳离子多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时还具有抗菌、消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生、修复、愈合的作用，并且具有很好的成膜性、柔韧性、吸水性和透气性[4]。本文将壳聚糖生物膜作为bFGF的载体，制备了bFGF壳聚糖涂膜剂，并建立了制剂中bFGF的含量检测方法。

1 仪器与试药

紫外可见分光光度计UV-1750（日本岛津公司）；电热恒温水浴锅HH.S11-4 （上海博迅实业有限公司）。碱性成纤维细胞生长因子溶液（1.03×106 U/mL，批号：080901，暨南大学赠送）；壳聚糖（分子量：100 000，脱乙酰度大于90%，浙江奥兴生物科技有限公司，批号：091213）；二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒（美国Promega公司，批号：KL140015A）；其他试剂均为分析纯。家兔，体重2～3 kg，性（沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：辽实动字20000105）。

2 方法与结果

2.1 涂膜剂的制备

无菌条件下，取bFGF溶液，加入注射用水稀释，配置成1.00 mg/mL的bFGF溶液（1.03×105 U/mL），经0.22 μm孔径的无菌滤膜过滤后备用；另取壳聚糖35 g，加入约600 mL 注射用水，滴加适量醋酸，使其自然胶溶，待完全溶解，加入甘油23.5 g，搅拌均匀，过滤后高压灭菌（10 kPa，30 min）。待冷却至室温后，加入配置好的bFGF溶液100 mL，搅匀，补充无菌注射用水至1 000 g。搅拌均匀后得无色黏稠澄明液体，按每支1.0 g分装，既得[5]。

2.2 含量测定

2.2.1 测定方法 取bFGF壳聚糖涂膜剂样品1支，以注射用水稀释并定容至10 mL，采用二喹啉甲酸法检测bFGF的含量。精密移取稀释后样品0.1 mL，置于5 mL具塞玻璃试管中，加入2.0 mL二喹啉甲酸工作液混匀，将试管置于60℃恒温水浴中反应30 min，冷却至室温后用紫外分光光度计于562 nm波长处测定吸光度A[5]。

2.2.2 标准曲线制备 精密配制浓度分别为1、5、10、15、20、25 μg/mL的bFGF标准水溶液，按“2.2.1”项下检测方法进行测定，以吸光度A对标准溶液的浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A = 0.024C-0.009 3，r = 0.999 7，表明bFGF在1～25 μg/mL范围内线性关系良好，见图1。

2.2.3 精密度试验 取5.0、15.0、25.0 μg/mL的bFGF标准水溶液（低、中、高3个浓度），按“2.2.1”项下检测方法进行测定，每个浓度平行测定5次，并计算精密度。结果证明，3个浓度样品检测吸光值的RSD值均小于2.00%，符合分析要求，见表1。

2.2.4 回收率试验 按处方比例取空白辅料溶液与bFGF溶液混合，以注射用水稀释并定容至10 mL，配制5、15、25 μg/mL的bFGF标准壳聚糖溶液（低、中、高3个浓度），按“2.2.1”项下检测方法进行测定，将所得吸光值代入标准曲线，计算回收率，平均回收率为100.4%，RSD值为1.15%，符合分析要求，见表2。

2.2.5 含量测定 取制备的bFGF壳聚糖涂膜剂3批，按“2.2.1”项下检测方法测定bFGF的含量，计算实测值与标示量（100 μg/支）的比值，结果见表3。可见制备的bFGF壳聚糖涂膜剂的含量控制较精确。

2.3 家兔皮肤刺激性试验

选取体重2～3 kg的成年健康家兔5只，于给药前24 h在家兔背部脊柱两侧脱毛。每日每只家兔一侧给予bFGF壳聚糖涂膜剂0.2 g，另一侧为空白对照。24 h后用温水洗净，观察涂抹部位有无红斑和水肿等情况，持续给药1周，观察皮肤反应情况。结果表明制备的bFGF壳聚糖涂膜剂对皮肤无刺激性，使用安全。

3 讨论

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）为分子量16～18 KD的阳离子多肽，是体内最有效的细胞生成因子之一，目前由基因重组技术获得的bFGF作为促进各种创伤修复的治疗药物已在临床应用[2-3]。壳聚糖又名甲壳胺，是甲壳素脱乙酰的产物，是自然界存在的唯一碱性多糖，生物安全性好，已被证实具有促进创伤面再生、修复和愈合的功效，并且有良好的抑菌活性，同时壳聚糖的降解产物N-乙酰胺基-D-葡糖胺还是表皮细胞生长的必需营养物质[4]。碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖涂膜剂是由基因工程bFGF与辅料壳聚糖制备而成，两者结合能够更好的发挥促进伤口愈合的功效[6-7]。该制剂涂抹后能在皮肤上形成一层保护膜，连续使用对皮肤无刺激性。

二喹啉甲酸检测法（bicinchoninc Acid，BCA法）是一种改进的Lowery测定法[8]。Lowery法和考马斯亮蓝染色法等经典的蛋白含量测定方法，干扰因素较多，而制剂过程中必然要加入各种辅料，将对测定结果产生影响。BCA法使用单一检测试剂，生成的络合物稳定，反应简单，且几乎没有干扰物质的影响。实验结果表明BCA法灵敏度高，干扰物质少，可测出微克水平蛋白，样品量需要少，适合作为bFGF制剂研究中的含量测定方法。

本文设计的bFGF壳聚糖涂膜剂制备工艺简单、重复性好、含量测定方法简便准确，适用于制剂的质量控制。该制剂对皮肤无刺激性，但其稳定性和促进伤口愈合的作用还需要进一步研究。

[参考文献]

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[3] 李燕梅，黄亚东，项琪，等. bFGF/胶原蛋白复合海绵的研制及体内外药理学研究[J]. 中国药科大学学报，2010，41（1）：35-39.

[4] 谭伟，唐其柱，何金凤. 4%壳聚糖对大鼠污染创面愈合的影响[J]. 生物医学工程研究， 2010，29（1）：47-49.

[5] 陈勇，陈妍. 重组干扰素α1b壳聚糖涂膜剂的制备及质量控制[J]. 中国药房，2006，17（1）：27-28.

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[8] Smith PK，Krohn GT，Hermanson AK，et al. Measurement of protein using bicinchoninc acid[J]. Anal Biochem，1985，150（1）：76-85.

（收稿日期：2012-11-07 本文编辑：袁 成）