虎杖对肺纤维化大鼠肺泡灌洗液TNF-α和PDGF影响的研究

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摘 要:目的:动态观察虎杖对肺纤维化大鼠肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和血小板衍化生长因子(pdgf)两种细胞因子表达及肺组织病理变化的影响。方法:雄性SD大鼠,随机分成4组:正常对照组、模型组、地塞米松组、虎杖预防组。除正常对照组外,其余3组均采用博莱霉素(BLM)制作肺纤维化大鼠模型,每日灌胃给药,造模后3、7、14、28、42天取材。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测BALF中TNF-α和PDGF的含量,采用光学显微镜观察肺组织病理变化。结果:与模型组相比,地塞米松、虎杖预防组肺泡炎与肺纤维化病理程度显著降低;与模型组比较,地塞米松、虎杖预防组BALF中TNF-α和PDGF水平在早期明显下降。结论:虎杖能够降低肺组织肺泡炎和肺纤维化病理程度,下调BALF中TNF-α和PDGF水平,从而抑制或延缓博莱霉素致大鼠肺纤维化的发生和发展。

关键词:肺纤维化;BALF;TNF-α;PDGF;虎杖

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0043-05

Study on the Effects of Polygonum Cuspidate on TNF-α and PDGF in BALF of Pulmonary Fibrosis Rats

XIA Yongliang,LUO Xianfang,SONG Kang, WANG Yuan

(The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, Zhejiang, China)

Abstract:Objective:To observe dynamically the effects of polygonum cuspidate on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and platelet-derived growth factor (PDGF) in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of pulmonary fibrosis rats and the pathological changes of lung tissue.Methods:100 male SD rats were randomly divided into 4 groups:the normal control group (n=25), the model group (n=25), the dexamethasone (DXM) group (n=25), the polygonum cuspidate prophylactic group (n=25).Except the normal control group, other 3 groups were all adopted bleomycin(BLM) to set up rat model with pulmonary fibrosis by intragastric administration every day, and the materials were draw 3, 7, 14, 28,42 days after making models. The contents of TNF-α and PDGF in BALF were detected with Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), and the pathological changes of lung tissue were observed with optical microscope.Results: Compared with the model group, the degrees of alveolitis and pulmonary fibrosis decreased significantly in the dexamethasone group and the polygonum cuspidate prophylactic pared with the model group, the levels of TNF-α and PDGF in BALF decreased significantly in dexamethasone group and the polygonum cuspidate prophylactic group.Conclusion: Polygonum cuspidate can decrease the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis decreased significantly in the dexamethasone group and the polygonum cuspidate prophylactic group, as well as TNF-α and PDGF in BALF, so as to inhibit and delay the occurrence and development of pulmonary fibrosis of rats induced by bleomycin(BLM).

Key words:pulmonary fibrosis; BALF; TNF-α; PDGF; polygonum cuspidate

肺纤维化是多种肺系疾病或药物、放射线等损害发展到晚期的一种常见病理变化和共同结局,其患病率和病死率在呼吸系统疾病中日趋增长,但临床尚缺少有效的治疗方法和手段。本实验通过虎杖对肺纤维化大鼠进行干预,观察肺泡灌洗液中TNF-α和PDGF的蛋白的表达及肺组织的病理变化,探讨虎杖对这两种细胞因子的影响及对肺纤维化防治作用。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物雄性SD大鼠145只,清洁级,体重(200±10)g;购自上海实验动物中心,由浙江中医药大学动物实验中心饲养(环境温度25℃,湿度70%)。

1.1.2实验用药虎杖流浸膏(浓度1g/mL),由浙江省中医院制剂室提供;地塞米松,5mg/支,浙江仙居制药股份有限公司生产,批号:070509。

1.1.3 主要试剂和仪器大鼠TNF-α ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司),大鼠PDGF ELISA试剂盒(UNIONHONESE&ADL公司),Bio-Rad Model 550酶标测试仪等。

1.2实验方法

1.2.1动物造模主要参考文献报道[1]。

1.2.2分组及给药SD雄性大鼠100只,随机分成4组:①正常对照组(25只),②模型组(25只),③地塞米松组(25只),④虎杖预防组(25只)。正常对照组和模型组于造模后当天开始每天灌胃生理盐水4mL/kg,地塞米松组于造模后当天开始每天灌胃地塞米松4mL/kg(即1mg/kg),虎杖预防组于造模前2天开始每天灌胃中药虎杖4mL/kg(相当于生药量1g/mL)。每周称重,正常对照组、模型组、地塞米松组及虎杖预防组分别于造模后3、7、14、28、42天各处死5只。 1.2.3标本收集

①肺组织的收集:大鼠浸泡于75%的酒精中3min后,在无菌室里,打开胸腔,结扎右主支气管,左肺行肺泡灌洗。分离右肺,生理盐水中漂洗干净,置10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24h,在最大横径处切取3mm厚组织固定,常规脱水、透明、浸蜡和包埋等制作成石蜡组织块和切片备用。

②BALF的收集:大鼠放血完毕后在无菌条件下行支气管肺泡灌洗。在超净工作台内无菌条件下,仰卧固定,颈部正中切开皮肤,钝性分离并暴露气管,右主支气管结扎后,在环甲软骨处剪一“V”形小口,将塑料套管(管径约1.5mm)插入气管,沿气管向肺部推进约1.5cm到左主支气管,用线结扎固定。大鼠处于头低脚高位(放于冰块上),用无菌注射器吸取4℃生理盐水(NS)3mL,将注射器与塑料套管相连,在30s～1min内将NS缓慢注入肺内,使NS液在肺内停留约30s,轻揉胸廓缓慢回抽灌洗液,再将所得液体缓慢注回肺内,如此反复3次,盛入15mL的离心管中,此为第1次灌洗,然后重复共5次上述操作,将灌洗液集于同一离心管中总量约15ml(回收率均>85%),取少量显微镜下计数细胞。其余BALF经无菌双层纱布过滤后移至无菌离心管中,离心(4℃,1000r/min,10min),取上清液5mL,放入-20℃冰箱保存备待测。

1.2.4标本检测

①光学显微镜观察肺组织结构变化:石蜡切片的HE染色(苏木素-伊红染色);石蜡切片的Masson染色。

②病理形态学定量分析 组织病理学的病变程度:根据Szapiel等[2]的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度,并参照张动伟等提供的标准将肺泡炎和肺纤维化分级并计算积分,进行病理半定量分析。具体标准见表1。

③BALF中PDGF的测定方法主要参考大鼠PDGF ELISA试剂盒。

1.3统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行统计。以P

2结 果

2.1 HE染色

见表2,图1。

正常对照组:肺内结构清晰,肺泡间隔未见增厚,无水肿、炎症及纤维化表现,肺泡腔内无明显渗出。

模型组:第3、7天时大鼠表现为明显的急性炎症期(肺实变),支气管周围、肺间质及肺泡内有大量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润,伴有水肿和轻度毛细血管增生;第14天时肺泡巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润明显,支气管肺泡上皮肿胀,肺泡萎缩压扁,肺泡隔明显增宽,有胶原沉积、纤维组织增生,出现轻度肺纤维化;第28及42天时肺组织结构破坏,肺泡腔明显缩小,肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代,形成肺间质纤维化。

地塞米松组:肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻。第3、7天时大鼠表现较模型组炎症轻度吸收,肺泡形态较好;第14天炎症吸收较明显,肺泡隔略增宽,轻微胶原沉积及纤维组织增生;第28天时有轻度淋巴细胞浸润,肺泡上皮略有肿胀,肺泡略萎缩压扁,肺泡隔增宽,可见少量胶原沉积及纤维组织增生;第42天时有较多纤维组织增生,肺泡腔缩小,部分肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代,形成轻度肺间质纤维化。

虎杖预防组:肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻。第3、7天时大鼠表现较模型组炎症轻度吸收,肺泡形态较好;第14天炎症吸收较明显,肺泡隔略增宽,轻微胶原沉积及纤维组织增生;第28天时有轻度淋巴细胞浸润,肺泡上皮略有肿胀,肺泡略萎缩压扁,肺泡隔增宽,可见少量胶原沉积及纤维组织增生;第42天时有较多纤维组织增生,肺泡腔缩小,部分肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代,形成轻度肺间质纤维化。

2.2 Masson染色

见表3,图2。

染色结果可见胶原纤维呈绿色,肌纤维呈红色,红细胞呈橘红色。

正常对照组:可见支气管壁胶原层较薄,肺泡区有少量纤细的胶原分布。

模型组:可见随着时间推移,肺间质、支气管壁和肺泡隔胶原染色中胶原纤维明显增多,小血管壁及其周围胶原分布较多,支气管周围胶原增生,并向肺间质延伸、在间质沉积。

地塞米松组:可见肺间质中、支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色较模型组明显减轻。

虎杖预防组:可见肺间质中、支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色较模型组明显减轻,与地塞米松组相似。

2.3BALF中TNF-α蛋白水平

正常对照组肺泡灌洗液中TNF-α水平在各时间点无明显变化。与正常对照组比较,模型组肺泡灌洗液中TNF-α水平在第3天开始升高,7天时即达到高峰,高于正常对照组(P

2.4BALF中PDGF蛋白水平

见表4～5。

正常对照组BALF中PDGF水平各时间点无明显变化。与同期正常对照组比较,模型组BALF中PDGF水平在第3天开始升高,7天时即达到高峰,高于正常对照组(P

3讨 论

虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖的根及根茎,别名阴阳莲、黄地榆、斑杖、苦杖、汤酸杆等。虎杖味微苦,性微凉,归肝、胆、肺经,具有清热解毒、活血化瘀、祛痰止咳、祛风利湿的功效,临床用于治疗肺热咳嗽、湿热黄疸、疮痈肿毒、关节痹通、经闭痛经等。现代药物化学研究,虎杖中主要含有蒽醌类,二苯乙烯类,萘醌类,黄酮类化合物,甾体类化合物及其它化合物,其中蒽醌类和二苯乙烯类是其最主要的活性成分。

肺间质纤维化是早期以肺泡炎,晚期以间质肺纤维化为特征的病理组织学变化,肺泡炎愈重,肺损伤及纤维化愈重。肺部病理形态的改变是最直观的疗效衡量标准。

本实验研究显示,模型组气管内注入博莱霉素后,3～7天主要以巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润,伴有水肿和轻度毛细血管增生;14天肺泡巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润明显,支气管肺泡上皮肿胀,肺泡萎缩压扁,肺泡隔明显增宽,有胶原沉积、纤维组织增生及成纤维细胞增多;28、42天少量炎性细胞浸润,肺组织结构破坏,肺泡腔明显缩小,肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代,肺间质纤维化形成。病理积分显示,模型组在3、7、14、28、42天肺泡炎积分均明显高于正常对照组(P

近年来,肺纤维化机制研究取得了许多非常重要的进展,提出了肺细胞和细胞因子网络的概念。当机体发生炎症时,这些细胞因子的相互作用,形成一套复杂的细胞因子网络体系,其中致纤维化细胞因子占优势从而发生肺纤维化改变[3]。目前研究认为,TNF-α和PDGF是导致肺纤维化较关键的细胞因子。肿瘤坏死因子-α[4-6]是一种细胞毒细胞因子,作为前炎症因子可增加中性粒细胞和嗜酸细胞的功能,并能刺激其产生超氧化物,释放溶酶体酶,对其周围细胞产生毒性作用,它还介导其它细胞因子和炎症因子的表达,并能刺激成纤维细胞的增殖。血小板衍化生长因子[5-7]是由多种细胞产生的肽类生长因子,它能通过促使上皮细胞、成纤维细胞发生有丝分裂促进这些细胞的增殖和分化,同时还能通过抑制胶原的降解来发挥其促纤维化的作用。运用ELISA法观察虎杖对肺纤维化大鼠BALF中TNF-α和PDGF的影响。研究发现,肺纤维化模型大鼠BALF中TNF-α和PDGF的水平随时间表现出类似的动态变化,模型组在第3天开始升高,第7天达到高峰,与正常对照组比较有显著性差异;第14天表达开始下降,直到42天与正常对照组比较仍有显著性差异。这说明BLM诱导TNF-α与PDGF的升高,在第7天达到高峰,可能与肺纤维化的急性炎症反应有关,而后它们水平的下降,可能与肺纤维化组织炎症反应逐渐减轻有关,持续到第42天时模型组TNF-α与PDGF的表达仍持续高于正常组,说明它们不但参与了肺组织的急性肺泡炎,且与肺纤维化的慢性炎症有关。

综上所述,早期应用虎杖能够抑制肺纤维化大鼠肺组织的炎症及病理程度,降低肺泡炎期BALF中TNF-α和PDGF水平,从而发挥其抑制或延缓肺纤维化的作用。

参考文献

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