新疆多民族族健康人群eNOS基因G894T多态性分析

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基金项目 新疆兵团医药卫生科技攻关计划课题(2006GG56)

摘 要 目的:研究新疆哈萨克族、土尔扈特蒙古族、汉族、维吾尔族健康人群内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因G894T多态性分布。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)的方法,分别对新疆哈萨克族、维吾尔族、土尔扈特蒙古族、汉族健康人群作eNOS基因G894T多态性检测,分类计数进行统计学处理。结果:新疆哈萨克族、维吾尔族、土尔扈特蒙古族、汉族健康人群eNOS基因GG、GT、TT基因型频率(P>0.005)及G、T等位基因频率(P>0.005)。结论:eNOS基因G894T多态性分布种族之间没有显著性差异,种族内等位基因型频率分布男女间差异无显著性(P>0.05)。

关键词 内皮型一氧化氮合成酶基因 多民族 多态性

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.205

AbstractObjective:To study the eNOS gene related topolymorphism of G894T in Han,Mongolian,Uyger and Hasake nationality.In Xingiang.Method:To polymerized chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)in healthy subjects of Han,Mongolian,Uyger and Hasake nationality in Xinjiang.the classified and countered results were processed by statistical analysis.Results:Test results show no significant difference in GG GT TT of eNOS genefrequency(P>0.005)in healthy subjects of Han,Mongolian,Uyger and Hasake nationality.In Xinjiang,and theallele frequency of G and T(P>0.005).Conclusion:There is an ethnic no difference in the distribution of the NOS gene related topolymorphism of G894T,not associated with the gender(P>0.005).

Key WordseNOS gene;polymorphism;Multi ethnic group

eNOS是心血管系统中合成NO的主要酶。eNOS基因第7外显子第78位碱基即编码序列第894位碱基发生G突变为T(G894T),导致第298位氨基酸残基发生谷氨酸被天门冬氨酸代替(GIu298Asp)。GIu298Asp变异与冠心病及急性心肌梗死的发生显著相关[1]。国内有关多民族健康人群enos基因多态性的研究鲜见系统报到。本研究旨在了解新疆哈萨克族、土尔扈特蒙古族、汉族、维吾尔族健康人群内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因g894t多态性分布情况。

资料与方法

一般资料:新疆地区哈萨克族无血缘关系、健康体检者70例,男31例,女39例,平均年龄39.8±6.4岁;汉族91例,男44例,女47例,平均年龄43.1±10.8岁;吐尔扈特蒙古族87例,男46例,女41例,平均年龄47.5±8.9岁;维吾尔族82例,男46例,女36例,平均年龄41.6±6.1岁。4组测试者肺、肾、肝功能正常,无心、脑血管病、内分泌病史和高血压病史(按WHO标准,收缩压,≤ 140mmHg;舒张压≤90mmHg。研究对象均自肘静脉采血3ml加0.5ml ACD抗凝,充分混匀后放入-20℃冰箱冷藏室保存待检。

主要仪器:MastercyclerReppendorf PCR仪(梯度核酸扩增仪),购自上海艾本德生物技术国际贸易有限公司;2.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色、上海生物工程有限公司试剂盒。UVP AC暗箱+GEL相机凝胶成像仪,购自天美有限公司。

DNA的提取:低渗溶血法破红细胞,采用蛋白酶K消化,饱和酚/氯仿抽提法提取白细胞基因组DNA,最后加TE溶解DNA,-20℃下放置,检测时BioRad紫外分光光度计测定DNA浓度并标化至100ng/μl。

多聚合酶链反应检测eNOS基因G894T多态性:①引物设计与合成:参照文献[2]设计引物,primer上游引物:5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3';下游引物:5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3'。②PCR扩增:反应体系为25μl,包括DNA模板1.0μl,10X reaction Buffer (Mg++ )2.5μl,dNTPMix 2.0μl,primer F引物0.2μl,primerR引物0.2μl Taqpolymerase0.2μl,pure water 18.9μl。③PCR仪扩增反应条件:预变性为95℃ 2分钟,变性95℃ 30秒,退火66℃ 30秒,延伸72℃ 30秒,共37个循环,最后72℃延伸5分钟。扩增后的PCR产物为248bp,经2.5%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,100V,30分钟,置凝胶成像仪上观察特异性条带,打印并记录了实验结果。④基因型检测:限制性酶切反应体系10μl,包括PCR产物8.4μl、10×buffer 1μl、Ba II内切酶(大连宝提供)0.6μl,37℃酶切2小时终止。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪成像,观察基因型。