硫素水平对韭菜硝酸盐累积和氮代谢关键酶活性的影响

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摘要：以日光温室多年生韭菜新世纪雪韭为试材，研究了土壤不同硫磺（S）施用量对韭菜硝酸盐含量、氮代谢关键酶活性和叶绿素荧光动力学参数的调控效应。结果表明，随着硫磺施用量的增加，韭菜叶片硝酸盐含量呈先减少后增加的趋势，当硫磺施用量为7.2 kg/hm2时硝酸盐含量最低，较对照减少7.2%；韭菜产量、硝酸还原酶（NR）活性、PSII最大光化学量子产量（Fv/Fm）、电子传递速率（ETR）和叶绿素含量则表现出先增加后降低的趋势，均以硫磺施用量7.2 kg/hm2时达到最大值，其中NR活性和ETR分别比对照提高了10.7%和25.8%；另外，谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）活性随硫磺施用量的增加呈逐渐增加的趋势，硫磺施用量为54.0 kg/hm2时，GPT和GOT的活性达到最高，分别比对照增加了22.5%和9.4%。

关键词：硫磺；韭菜；硝酸盐累积；氮代谢关键酶

中图分类号：S633.3；S147.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-4882-04

Effects of Sulphur Levels on Nitrate Accumulation and Nitrogen Metabolism Activities of Key Enzymes in the Leaves of Chinese Chive

XIE Xin1，DUAN Li-xiao2，WANG Jun-ling3，GAO Zhi-kui1

（1. College of Horticulture， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；2. Baoding Institute of Strawberries， Baoding 071000，Hebei，China；3. College of Life Sciences， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China）

Abstracts： The regulatory effects of soil concentration of sulfur processing on nitrate content， nitrogen metabolism activities of key enzymes and chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of Chinese chive were studied in sunlight greenhouse. The results showed that the nitrate content first decreased and then increased with the increase in the sulfur concentration. When the sulfur concentration was 7.2 kg/hm2， the nitrate contend was the lowest and then decreased by 7.2% compared with the control. The production， nitrate reductase（NR） activity， PSII maximum quantum yield （Fv/Fm）， electron transport rate（ETR） and chlorophyll content of Chinese chive showed a decreasing trend after the first increase. The maximum was in sulfur concentration of 7.2 kg/hm2 comparing with the control. NRA and ETR increased 10.7% and 25.8%， respectively. In addition， glutamate pyruvate transaminase（GPT） and glutamate oxaloacetate transaminase（GOT） activity showed a gradual increase trend with the increase of S concentration. When concentration of S was 54.0 kg/hm2， GPT and GOT activity reached the highest level and increased by 22.5% and 9.4% comparing with the control.

Key words： Sulfur； Chinese chive； nitrate accumulation； nitrogen metabolism activities of key enzymes

蔬菜容易富集硝酸盐[1]，其富集的过量硝酸盐危害人体健康，且日益受到人们的关注，普遍认为蔬菜硝态氮吸收大于还原是产生硝酸盐累积的根本原因[2，3]。为了限制硝态氮的吸收，目前国内外的一些研究与生产中，以减控氮素供应量来调控[4]，虽然显著降低了硝酸盐的累积，但导致蔬菜不同程度的减产和品质的下降。

近年来，由于作物复种指数的提高，加之不含硫的高浓度肥料的普遍应用，使得越来越多的国家和地区出现了土壤缺硫情况[5-9]，缺S胁迫会阻碍N代谢及蛋白质的合成，引起植株体内N中间产物（硝态、氨基态等）的积累，从而导致蛋白质含量的降低[10，11]。施硫可显著降低土壤的pH，有利于减少土壤氨的挥发[12]，增加土壤含氮量，同时能有效抑制NH4+向NO3-的转化[13]，从而降低硝酸盐的累积，但降低程度和土壤中硫的施用量有关[14，15]。吴曦等[14]研究表明，土壤中施适宜的硫磺可明显降低油菜体内NO3--N含量，提高硝酸还原酶活性，硫磺用量过高时会抑制油菜的生长。过量施用硫磺会引起土壤中SO42-浓度过高，从而抑制植物根系对NO3-、HMoO4和H2BO3的吸收，诱发植株体内硝酸还原酶的重要组分Mo和B的缺乏，降低植株体内硝酸还原酶活性。因此，筛选土壤中的适宜硫施用量对降低硝酸盐累积，提高蔬菜品质有着重要的意义。

本研究针对韭菜生产中硝酸盐累积问题，基于氮-硫代谢的偶联与相关平衡关系，分析不同施用量的硫磺对韭菜叶片硝酸盐含量、氮代谢相关酶活性、叶绿素荧光参数的变化以及氮代谢产物的影响，筛选出降低韭菜硝酸盐累积效果显著的硫磺施用量，探讨硫磺降低韭菜硝酸盐累积的调控机制，为绿色蔬菜的栽培提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

以多年生日光温室韭菜新世纪雪韭为试材，试验于2010年2月5日在河北农业大学东校区日光温室进行，农艺管理按常规进行。采收前9 d采用硫磺（S）根施，设5个处理水平：0.0 kg/hm2（S0）、7.2 kg/hm2（S1）、18.0 kg/hm2（S2）、36.0 kg/hm2（S3）和54.0 kg/hm2（S4），每处理3次重复。于处理后第 9天进行韭菜生理生化指标的测定。

1.2 试验方法

收获时每个处理随机抽取10株韭菜单株，测定地上部的鲜重，之后在105 ℃杀青10 min，再转移到60 ℃烘干至恒重，测其干重。3次重复，取平均值。

硝酸盐含量采用改进的紫外差减法测定[16]，硝酸还原酶（NR）活性采用分光光度法测定[17]，谷氨酰胺合成酶（GS）活性参照王月福等[18]的方法，谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT） 活性采用吴良欢等[19]的测定方法，叶绿素含量采用SPAD-502叶绿素计进行测定。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定[17]，游离氨基酸含量采用水合茚三酮法测定[17]，所有测定3次重复，数据采用Excel 2003进行整理、分析和作图。

叶绿素荧光参数的测定采用德国WALZ公司生产的调制式荧光成像系统（MINI-IMAGING-PAM）[20]。将韭菜叶片暗适应20 min后，在测量光[强度为0.5 μmol/（m2·s），脉冲频率为1 Hz]下诱导产生初始荧光（F0），随后用饱和脉冲光[强度为2 500 μmol/（m2·s），脉冲光时间为0.8 s]激发产生最大荧光（Fm）。当荧光从最大值降至接近F0水平时，用光化光[强度为156 μmol/（m2·s）]来诱导荧光动力学，且每隔20 s打开饱和脉冲进行荧光参数Fm′和Fs的测定。在每个样品测定光诱导动力学曲线后，从动力学曲线中导出所需要的参数数据，进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 硫磺对韭菜产量和硝酸盐含量的影响

从图1可以看出，随着硫磺施用量的增加，韭菜植株地上部鲜重表现出先上升后下降的变化趋势。当土壤施硫7.2 kg/hm2时，韭菜产量为最高，比对照S0提高了10.6%。反映出适宜硫磺施用量可以促进韭菜的生长，提高产量；另外，从图1中还可以看出，硫磺处理韭菜叶片的硝酸盐含量均随着硫施用量的增加呈现先减少后增加的变化趋势，当土壤施硫7.2 kg/hm2时韭菜硝酸盐含量最低，较对照S0相比减少了7.2%。

2.2 硫磺对韭菜氮代谢关键酶NR、GS、GOT和GPT活性的影响

硝酸还原酶（NR）是氮素同化的关键酶，其催化的反应是NO3-同化为NH4+的限速步骤。由图2可以看出，施硫处理能提高NR的活性，但NR活性随土壤施硫量的增加呈现先升高后降低的变化趋势，当土壤施硫为7.2 kg/hm2时，NR活性最高，比S0提高了10.7%（图2）。由此可以看出，施硫可以加速氮同化的启动，但硫施用量过高时，对NR活性有抑制的作用，可能是硫同化和氮同化竞争活化能量的原因。随着硫施用量的增加，硫磺处理后的韭菜叶片GS活性表现出逐渐升高的趋势（图2）。

谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）为2个重要的转氨酶。硫磺处理后的第9天，随着硫施用量的增加，GOT和GPT活性均表现出逐渐增加的趋势（图3），硫施用量为54.0 kg/hm2时效果最为显著，比对照S0分别增加了9.4%和22.5%。

2.3 硫磺对韭菜叶片叶绿素荧光动力学参数的影响

土壤施用硫磺后，韭菜叶片叶绿素a和叶绿素b含量均随着硫施用量的增加呈现先增加后降低的趋势（表1），当硫施用量为7.2 kg/hm2时，硫磺处理的韭菜叶片叶绿素a和叶绿素b含量均达到最大，比对照S0分别提高了16.9%、15.5%。从表1中还可看出，土壤施硫处理均可提高韭菜叶片的吸光系数（Abs），当硫施用量为7.2 kg/hm2时达到最高，比对照S0提高了10.2%。当硫施用量大于7.2 kg/hm2时，韭菜叶片Abs随着硫施用量的增加逐渐下降。

随着硫施用量的升高，硫磺处理后的韭菜叶片PSII最大光化学量子产量（Fv/Fm）、韭菜叶片ETR、韭菜叶片实际光化学量子产量Y（Ⅱ）和调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）均呈现出先增加后降低得趋势（表1）。硫施用量为7.2 kg/hm2时达到最高，而非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）呈现出相反的变化趋势。

2.4 硫磺对韭菜氮代谢产物的影响

由图4可以看出，韭菜叶片可溶性蛋白的含量随硫施用量的增加而增加，不同水平的硫处理比S0分别提高了13.9%、9.9%、6.6%和5.2%。植物的干物率在一定程度上可以反映出植物在一段时间内的物质积累量，不同硫水平下的韭菜幼苗干物率随着硫施用量的增加表现出先增加后降低的趋势（图4），其中，在硫施用量为7.2和18.0 kg/hm2时干物率增加效果最为明显，分别比对照S0提高了6.86和7.9个百分点。韭菜叶片中游离氨基酸的含量随硫施用量的增加呈先增加后降低的趋势（图5），在硫施用量为7.2 kg/hm2时达到峰值，为24.5 mg/100 g（FW）。

3 讨论

在氮代谢NO3-到蛋白质的整个过程中，NR作为重要的调节酶和限速关键酶，调控整个氮素还原同化进程[21]。NR活性受底物（细胞质内硝酸盐）浓度所诱导[22]，但过量的硝态氮会被运输到液泡中贮积备用[23]。叶勇等[24]认为一定的硫水平能明显提高硝酸还原酶（NR）的活性，促进氮素代谢。本试验结果发现，NR活性随着硫施用量的增加呈先上升后下降的趋势，也反映出适宜的硫施用量有促进韭菜叶片硝酸还原酶的生成和激活作用，而硫施用量过高反而会降低NR活性，可能是由于硫素施用量过高会导致氮硫同化竞争活化能量，表现出对硝酸还原酶的抑制，从而影响植物氮代谢的顺利进行[25]。提高植物体内NR活性从理论上可以提高氮素的利用率，降低蔬菜中硝酸盐的含量。然而，基因表达和蛋白质水平上的研究方法已经表明，酶的总量不是限制胞内NR活性的因素，NR在复杂的转录和翻译水平上被调节。因此，硫对NR活性的调节机制还要在分子水平上进一步研究。本试验还发现，施硫可提高GS、GOT和GPT活性，说明施硫不仅促进了韭菜叶片氮代谢中硝酸盐的还原与同化，同时还调动转氨作用的积极协同配合，促进了硝态氮转化为游离氨基酸和可溶性蛋白，这可能是土壤施硫处理降低韭菜硝酸盐累积的一个重要原因。

硫的供应水平对叶绿体的形成和光合作用的改善有重要影响。刘中良等[26]试验研究指出，硫肥可显著提高大蒜叶片叶绿素含量，增强光合作用。刘丽君等[27]研究表明，施硫能增加大豆叶面积，并显著提高大豆叶绿素含量，有利于增加产量。朱英华等[28]等研究指出，施用适宜量的硫对烟草叶片光合有效量子产量（EQY）、光合电子传递速率（ETR）、光化学淬灭（qP）有明显提高作用，高硫或低硫都会导致烟草EQY、ETR、qP降低和NPQ的升高。本研究结果亦表明施硫可提高韭菜叶片叶绿素的含量，且适宜施用量的硫磺可促进PSⅡ的光能捕获、吸收与传递更多的能量，为氮代谢（如亚硝酸盐还原和氨同化）和硫代谢（如硫酸盐还原）等提供充裕的能量，提高光合效率。光合作用的改善对提高生物累积量、可溶性糖、C-骨架和韭菜的产量奠定了基础。另外，施用硫磺后韭菜叶片生长量增大，对硝态氮产生了稀释效应，使单位重量蔬菜NO3-的含量下降，从而降低了硝酸盐的累积。

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