养血消风饮对小鼠接触性皮炎的作用及超微结构影响的实验研究
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摘 要:目的:利用小鼠耳廓及背部变应性接触性皮炎模型进行自拟方养血消风饮的药效学研究,为更好地临床应用及药物开发奠定基础。方法:动物分为空白组、模型组、中药治疗组、西药对照组,用二硝基氯苯(DNCB)同时建立小鼠耳廓及背部变应性接触性皮炎模型,对比观察用药治疗前后动物模型耳肿胀度、脏器指数及超微结构的变化。结果:中药养血消风饮可以减轻动物模型的耳肿胀度,降低动物模型的胸腺指数、脾指数,并能够减轻DNCB对动物皮肤超微结构的破坏程度。结论:养血消风饮对小鼠接触性皮炎的发生有抑制作用。
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0163-03
The Experimental Study of the Influence of the Herbal Medicine
Yangxue Xiaofeng Drink on ACD Mouse Model and its Ultrastructural Changes
LU Yuan1,LIU Honghui2,Advisor:GUAN Hongquan3
(1.The Attached Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,Liaoning,China;
2.The Vocational Technical College of LiaoningUniversity of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110101,Liaoning,China;
3.The Basic Medical College of LiaoningUniversity of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,Liaoning,China)
Abstract:Objective:To testing the efficacy of the herbal medicine Yangxue Xiaofeng Drink by usingthe mouse models of Allergic Contact Dermatitis(ACD)on its auricles and dorsum,which couldestablish the foundation for clinical application and new drug development.
Methods:All the mouses are seperated into four groups:blank group,model group,traditional Chinese medicine treatment group,western medicine control group.To build up an ACD mouse model stimulated on its auricles and dorsum by DNCB,then give different treatment to each group,after that measure the swelling degree of mouse's auricles,viscera index,and its ultrastructure of dermal.
Results:The herbal medicine Yangxue Xiaofeng Drink could reduce the swelling degree of mouse′s auricles,reduce thethymus index and spleen index,and it also lighting the degree of injury on its ultrastructure of dermal.
Conclusion:It showed inhibition of the herbal medicine Yangxue Xiaofeng Drink against ACD mouse model.
Key words:allergic contact dermatitis(ACD);animal model;ultrastructure;experimental study
变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis,ACD)属IV型超敏反应性皮肤病,是皮肤接触外源性刺激物或致敏物(抗原)后在局部发生的急性或慢性皮炎,是皮肤科的常见病。该病处理不当可在皮炎的基础上继发湿疹样变,而呈慢性变应性接触性皮炎(又称接触性湿疹)的病理改变,其治疗又成为皮肤科的疑难问题。
养血消风饮是本院皮肤科田静教授集数十载临床经验总结并经临床验证疗效确切的方剂,临床证明其对接触性皮炎疗效确切,故本实验分别利用小鼠耳廓及背部急性ACD动物模型,从量化指标和形态学评价该方的作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
昆明种小鼠,体重18～22g,由沈阳医学院实验动物中心购进,合格证号:SCXK(辽)2003-0016。选取动物40只,为耳廓造模鼠,随机分为4组:空白组、模型组、中药治疗组、西药对照组,每组10只;另取40只动物,为背部造模鼠,分组同上,每组10只。
1.2 试剂与仪器
丙酮,沈阳市远航化工有限公司,批号:20040805;2,4-二硝基氯苯(DNCB),军事医学院药材供应站,批号:991223,规格25g,以4:1丙酮橄榄油分别配制成7%和1%DNCB丙酮橄榄油溶液(简称DNCB溶液);硫化钠,上海统亚化工科技发展有限公司,批号:070928;锇酸(OsO4,)英国原产,上海化学试剂厂分装;环氧树脂Epon812,日本电子公司电镜专用包埋剂。
耳肿打孔器(YLS-Q4,山东省医学科学院研制); 电子分析天平(A100S,沈阳天平仪器有限公司);超薄切片机(瑞典LKB公司LKBV型);透射电镜(JEM-100CXII型,日本电子公司),眼科剪、镊子等手术器械由辽宁中医药大学药理实验室提供。
1.3 实验方法
1.3.1 灌胃中药的制备
养血消风饮组方为:当归20g,生地20g,白芍20g,荆芥15g,防风25g,白鲜皮20g,蝉蜕20g,制首乌25g,鸡血藤25g,刺蒺藜15g,甘草15g。
以传统方法制成煎剂,以体表面积折算[2],按每天成人用药等效剂量4倍灌胃给药,调整生药含量为2.28g/0.4mL(即给药剂量为114.4g/kg),煎药浓度为570%(即每毫升煎剂含生药5.7g)。
1.3.2 造模及给药方法
各组小鼠均在背部2cm×2cm范围用Na2S脱毛,背部造模鼠同时也在腹部2cm×2cm范围脱毛,按照如下方法进行造模:实验开始的第1天,耳廓造模鼠用加样器量取7% DNCB溶液25μL涂抹于实验组小鼠背部致敏,背部造模鼠在腹部脱毛区同上方法致敏,第2天再强化1次。第7天在鼠右耳双面涂抹1% DNCB溶液5μL激发,背部造模鼠在背部脱毛区涂抹DNCB溶液15μL激发。空白组小鼠也同上涂抹等量蒸馏水。
中药治疗组每日灌胃剂量为0.4mL,西药组对照组灌服氯雷他啶(商品名:开瑞坦,国药准字H10970410,上海先灵葆雅制药有限公司生产),用生理盐水溶解制成混浊液,按成人4倍等效剂量灌胃,每次给药0.104mg/0.4mL(即给药剂量为0.0052g/kg)。空白组、模型组给予生理盐水灌胃。以上各组小鼠均调整日灌胃剂量为0.4mL,每日给药1次。灌药自致敏前1天开始,每天1次,再于激发前2h及激发后6h灌药1次。
1.3.3 造模及给药方法
激发24h后处死全部小鼠,立即剪下小鼠左右耳廓备检。激发后24h将动物颈椎离断处死,耳廓造模鼠立即剪下双侧耳廓备检。使用0.6cm的金属耳肿打孔器在左右耳中部打孔,取相同大小的耳组织,使用电子天平称重,计算左右耳重量差。再以小鼠左、右耳片重量差值(mg)作为鼠耳ACD反应的强度,并计算肿胀抑制百分率;同时完整摘取小鼠脾及胸腺,用电子天平测定其重量,分别以每10g小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作为脾指数和胸腺指数。
小鼠耳廓肿胀抑制百分率计算公式如下:
肿胀抑制百分率(%)=ACD模型组肿胀mg数-给药组耳肿胀mg数对照组耳肿胀mg数
背部造模鼠处死后将背部激发区皮肤全层剪下,在置于冰块上的平皿上切成1mm3小块3~4块,立即投入磷酸缓冲液(PBS)配置的2.5%戊二醛中前固定2h以上;PBS漂洗液漂洗后,1%锇酸后固定1h;乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂Epon812浸透过夜,包埋,40℃、60℃各20h常规聚合,LKB-V超薄切片机切片,厚度约500~600,醋酸铀、柠檬酸铅双染色,JEM-100CXII型透射电镜下观察并拍片。
1.4 统计学方法
统计数据以±s表示,采用t检验,用SPSS 10.0软件进行统计学分析。
2 结 果
2.1 检测结果分析
用±s表示耳重量差(mg)。
从表1可见模型组的耳重量差值明显高于空白组,说明造模成功。中药治疗组和西药对照组的耳重量差与模型组相比明显减小,而中药治疗组和西药对照组两组之间无显著差异,说明养血消风饮对小鼠ACD有显著的抑制作用。
从表2可见模型组的脾指数和胸腺指数均明显高于空白组,中药治疗组和西药对照组均可显著降低脾指数和胸腺指数,说明养血消风饮对ACD小鼠的免疫器官有一定抑制作用。而中药治疗组和西药对照组两组之间无显著差异,说明养血消风饮对小鼠ACD有显著的抑制作用。
2.2 超微结构改变
见图1。
3 结 论
养血消风饮对小鼠ACD有抑制作用,能减轻其耳廓的肿胀度,提高肿胀抑制百分率。同时,能减轻其病变局部细胞超微结构的损伤,减少皮肤组织水肿,减轻ACD对细胞间连结和对细胞结构的破坏。
4 讨 论
变应性接触性皮炎(ACD)是皮肤科的常见病,系由接触致敏个体再次接触相应过敏源后在局部发生的急性或慢性皮炎,属皮肤迟发型(IV型)超敏反应,习惯上所说的接触性皮炎即指此型。
ACD多发生于工业化国家,常与职业性接触有关。现代生产力的高速发展、环境污染等因素促使更多的致敏原产生,导致ACD的发病率逐年上升。近30年来,全世界变态反应(又称为超敏反应)性疾病的发病率明显增高,世界变态反应组织(WAO)在30个国家对过敏性疾病的流行病学调查结果显示在这些国家12亿总人口中,共有2.5亿人(2%)患有不同种类的过敏性疾病。据美国20世纪80年代末统计,每年仅用于职业性接触性皮炎的花费就达数亿美元之多。在我国,一些小规模调查显示:北京居民的变态反应性疾病的患病率达到37.7%。据粗略统计,在北京协和医院变态反应科门诊,皮肤超敏反应病约占全部超敏反应病例的1/3。而临床上超敏反应性皮肤病往往找不到明确的诱因,易于反复发作,给社会造成很大影响。
现代医学对该病治疗上内服多选用抗组织胺类、糖皮质激素治疗,但是虽然大多数抗组织胺药对炎症介质有拮抗作用,可以抑制肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒、抑制组织胺释放,对I型(速发型)超敏反应有较好的疗效,但针对IV型(迟发型)超敏反应,其疗效及确切机制不明,且其并不能抑制病变部位炎细胞的浸润,因此,仅能起到镇静止痒、缓解自觉症状的作用,并不能改善局部炎症浸润及皮损情况;糖皮质激素类药物虽然有显效快、作用强、疗效确切等优点,但同时又具备药效持续时间短、无预防作用、副作用明显等缺点,一般多用于重症、急症患者,而不适合在临床上长期应用。IV型超敏反应的发生由于往往找不到明确的过敏源,常反复发作,用药期较长,上述药物显然不是该类疾病的理想用药。
自拟方养血消风饮是在《医宗金鉴》的当归饮子的基础上化裁而成,养血活血、祛风止痒,常用于治疗反复发作的慢性接触性皮炎中医属血虚风燥证型的皮肤病,临床证明其疗效确切,但尚缺乏客观量化的指标进行验证。
实验结果表明,养血消风饮煎剂可以抑制动物模型的超敏反应程度、抑制动物模型脾脏和胸腺增大的反应,并可明显改善ACD小鼠局部病变组织中细胞超微结构的改变,可使细胞结构完整,缩小增宽的基底细胞间隙,使细胞间连接得以恢复,使核内染色质基本呈均匀分布,可使各层组织结构的损伤得到明显减轻。说明养血消风饮可以有效抑制皮炎的发生并能减轻病变局部细胞超微结构的损伤程度。
参考文献
[1] 芦源,刘鸿慧,田静.养血消风饮配合外治治疗颜面再发性皮炎56例[J].辽宁中医杂志,2009,36(4):589-590.
[2] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:1103.