大鼠心肌缺血再灌注后结蛋白的变化
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇大鼠心肌缺血再灌注后结蛋白的变化范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘要】 目的：探讨缺血再灌注损伤后大鼠心肌细胞内结蛋白分布状况与含量的变化。方法：30只成年健康雄性SD大鼠，随机分为缺血组、缺血再灌注组及假手术组。缺血组实施手术结扎冠状动脉30 min后即刻取材，再灌注组缺血后再灌注120 min后取材，假手术组实施同样的手术过程但不结扎。应用免疫荧光标记技术和图像定量分析方法对大鼠心肌细胞结蛋白分布及含量的变化进行研究。结果：缺血组和缺血再灌注组心肌结蛋白在心肌细胞内的分布较假手术组的有序分布发生改变，变得无序而紊乱，心肌纤维横纹不再清晰，变得断续而模糊。缺血组和缺血再灌注组心肌结蛋白含量显著低于对照组（P
【关键词】 心肌； 缺血再灌注； 结蛋白
Changes of Desmin after Rat Myocardial Ischemia Reperfusion/BAI Xue-mei.//Medical Innovation of China，2013，10（26）：006-008
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of ischemia reperfusion rat myocardial desmin distribution and content change.Method：30 healthymale SD rats were divided into ischemia group，ischemia reperfusion group and sham operation group.The ischemia group immediately sampled after the operation of coronary artery was ligated of 30 min，the reperfusion group sampled after reperfusion 120 min，the sham operation group to implement the same operation without ligation.Immunofluorescence staining and image quantitative analysis method were used to study the changes of myocardial desmin distribution and content in rats.Result：The myocardial desmin distribution of ischemia group and ischemia-reperfusion group became disordered，myocardial fiber stripes became blurred.Ischemia group and ischemia-reperfusion group myocardial desmin content was significantly lower than that in the control group （P
【Key words】 Myocardium； Ischemia reperfusion； Desmin
First-author’s address：The Eighth Hospital of Baotou City，Baotou 014040，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.26.003
缺血组织恢复血流灌注时，导致再灌注区细胞和局部血管网显著的病理生理变化，这些变化共同作用可促进进一步的组织损伤，该病理过程称为缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）。缺血心肌的再灌注损伤可通过一定的病理学机制导致某些执行特定功能的蛋白质的降解和表达异常，继发心肌细胞超微结构的改变，从而影响心肌正常的生理功能[1]。结蛋白（desmin）为细胞骨架蛋白，大量存在于心肌细胞内，结蛋白中间丝将Z带与细胞膜及细胞核相连接，这些细丝对肌丝的组成和细胞结构的维持有重要作用。有研究发现，结蛋白对于维持肌肉正常的机械功能是必需的，结蛋白的破坏或表达异常可能造成肌肉机械功能的障碍[2]。
本研究制定了缺血再灌注实验动物模型，观察实验大鼠在缺血后即刻和再灌注后心肌结蛋白分布状况及含量的变化，试图为探讨缺血后及缺血再灌注后心肌损伤及其机械功能异常的发生机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 选用健康成年雄性SD品系大鼠30只，体重（260±8）g。将选用大鼠随机分为缺血组、缺血再灌注组和假手术组，每组10只。两组大鼠体重比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 ml/100 g体重）麻醉，利用气管插管接鼠类动物呼吸机进行人工呼吸（潮气量20 ml/kg，频率60～80次/min），心电监护仪监测其心电变化。开胸后于左冠状动脉前降支起始2～3 mm处用4.0手术缝合线穿过动脉深面备用，用一细小柔软胶片垫于血管与结扎线之间，待呼吸、血压平稳15 min后结扎，30 min后剪除结扎线再灌注120 min后处死大鼠。结扎成功参照标准：结扎点远端动脉分布区域心肌颜色发绀，心电图QRS波群增高增宽，ST段抬高。再灌注成功参照标准：缺血部位心肌颜色恢复至正常水平，抬高的ST段至少下降50%。缺血组结扎30 min后即刻处死取材。假手术组手术过程参照实验组，差别是在穿线后不结扎，30 min后取下缝合线，关闭胸腔，120 min后处死大鼠。
1.2.2 大鼠心肌取材切片 处死大鼠后迅速取出心脏，生理盐水清洗后迅速于梗死区域（假手术组在相同区域）切取心肌组织，置于冰冻切片机专用标本盘，滴加OCT包埋剂后连同标本盘迅速置于液氮内冷冻20 s后转入冰冻切片机切片箱，切取7 μm厚的冰冻切片置于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.2.3 心肌冰冻切片的免疫荧光染色 结蛋白于心肌细胞内及闰盘处表达，选用FITC荧光标记，具体步骤如下：（1）将冰箱保存的冰冻切片取出，室温复温30 min后用4 ℃丙酮液固定10 min，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（2）滴加10%正常山羊血清封闭，室温下孵育10 min；（3）倾去血清后勿洗，滴加经PBS 1：100稀释的小鼠抗大鼠结蛋白抗体，4 ℃过夜，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（4）滴加经PBS 1：100稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG，37 ℃下孵育1 min，用PBS缓冲液漂洗3次，5 min/次；（5）滴加60%的缓冲甘油封片。
1.2.4 免疫荧光图像的采集和分析 使用Leica AS MDW激光共聚焦成像工作站采集结蛋白的免疫荧光标记图像，所有图像均采用同一曝光时间及相同的条件采集。每张切片于缺血区域随机选取心肌纵切视野5个，将数字图像储存以待分析。应用JD801图像分析系统对数字图像进行定量分析，测定结蛋白阳性表达部位的积分灰度值，以积分灰度值的大小代表结蛋白表达量的多少，对缺血再灌注损伤后心肌结蛋白进行定量分析。
1.3 统计学处理 图片定量分析采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间进行单因素方差分析，以P
2 结果
2.1 大鼠心肌结蛋白免疫荧光图像 图1为假手术组心肌纵切的结蛋白免疫荧光标记图像，绿色点状和块状荧光斑即为结蛋白，可见假手术组心肌结蛋白在心肌细胞的胞浆内均匀的分布，在心肌细胞闰盘处分布增多，图片中可见心肌纤维横纹清晰。图2和图3为缺血后即刻和再灌注后120 min后的结蛋白免疫荧光图像，可见在不同心肌细胞或者同一心肌细胞的不同部位结蛋白分布不再均一，呈现局部或增多或减少甚至缺失，两组心肌纤维横纹亦变得模糊不清。
2.2 大鼠心肌结蛋白的免疫荧光图像定量分析 经计算机软件的定量分析，假手术组缺血区结蛋白含量为（2 317 358±
329 937），缺血组缺血区结蛋白含量为（2 168 051±305 137），
缺血再灌组缺血区结蛋白含量为（1 986 050±335 629）。由此可得，缺血组和缺血再灌注组心肌结蛋白含量显著低于假手术组，缺血再灌注组心肌结蛋白含量显著低于缺血组，差异均有统计学意义（P
图1 正常心肌（假手术组）结蛋白免疫荧光图像 （×200）
注：绿色点状或块状荧光斑为结蛋白，可见结蛋白均匀分布于心肌细胞内，在闰盘处分布增多，心肌纤维横纹清晰可见
图2 缺血组心肌结蛋白免疫荧光图像 （×200）
注：结蛋白分布不再均一，呈现局部或增多或减少甚至缺失，两组心肌纤维横纹亦变得模糊不清
图3 缺血再灌注组心肌结蛋白免疫荧光图像 （×200）
注：结蛋白分布不再均一，呈现局部或增多或减少甚至缺失，两组心肌纤维横纹亦变得模糊不清
3 讨论
在心肌细胞，结蛋白（desmin）中间丝主要存在于Z带和闰盘，排列成相互交错的三维网状结构，将Z带与细胞膜及细胞核连接，从而使众多的单个肌原纤维连接起来，将所有肌原纤维的单个收缩运动机械地整合在一起，形成合力。同时，结蛋白在细胞内收缩蛋白间架起或平行或交错的网络框架结构，使收缩力沿纤维轴方向传递，限制肌节在肌肉收缩过程中被过度牵拉。有学者利用结蛋白基因敲除小鼠模型证明结蛋白缺失可导致心肌细胞超微结构异常改变、心肌细胞凋亡以及心肌机械功能障碍，这表明结蛋白对于维持心肌细胞超微结构、保证心肌正常机械功能功能是必需的[3]。
陈小波等[4]研究发现，心肌挫伤后早期以细胞的机械损伤为主，之后细胞内Ca2+浓度增高，继而由其介导的心肌结蛋白降解增加。心肌缺血再灌注损伤后的病理改变与前者类似，细胞内钙超载是心肌缺血再灌注损伤的主要病理机制，超量Ca2+与执行特定功能的各种相关蛋白结合导致心肌细胞凋亡启动以及损伤的心肌细胞进行电重构，还可导致细胞膜相结构的破坏[5]。心肌缺血再灌注损伤后由于Ca2+激活了某些细胞骨架蛋白的降解，心肌细胞超微结构受到损坏从而导致心肌机械功能的异常，即心肌顿抑。心肌顿抑（myocardial stunning）系指心肌缺血再灌注后，即使没有不可逆损害，即使冠脉血流恢复或接近正常水平，但仍持续存在的心肌机械功能异常，此种功能障碍是完全可逆的，只要给予足够的时间，心肌机械功能就可以完全恢复。由此可见，心肌顿抑是由于心肌缺血再灌注造成的可逆性损伤[6-9]。研究发现，在发生顿抑的豚鼠心肌内，由于Ca2+激活了细胞内的钙激活蛋白酶从而导致了心肌收缩功能障碍，致使诸如结蛋白、血影蛋白及α-辅肌蛋白等Z线相关蛋白的含量减少，从而反过来证明结蛋白等Z线相关蛋白的降解在心肌顿抑的发生中行使了重要的作用[10-11]。
实验结果显示，缺血组和缺血再灌组心肌结蛋白的分布状况发生了很大的变化，可见在不同心肌细胞或者同一心肌细胞的不同部位结蛋白分布不再均一，呈现局部或增多或减少甚至缺失，心肌纤维横纹亦变得模糊不清。两组心肌结蛋白含量显著下降，缺血再灌注组心肌结蛋白含量下降更为明显，这说明缺血后心肌结蛋白发生了一定程度的降解，而缺血后的再灌注则加重了心肌的损伤促进了结蛋白的降解。心肌的缺血再灌注损伤可造成心肌结蛋白的大量降解，致使细胞骨架结构遭到严重破坏，从而导致心肌机械功能的暂时障碍，即心肌顿抑。缺血再灌注后心肌结蛋白的降解造成心肌细胞骨架三维结构的破坏，而细胞骨架通过锚定诸如线粒体、细胞核、肌丝、高尔基体等亚细胞结构来维持细胞的稳定性，细胞骨架结构的破坏可能使细胞膜以及其他细胞器对各种损伤因子的敏感性增强，使细胞更易受到这些损伤因子的攻击而损伤；也就是说结蛋白的降解既是心肌缺血再灌注损伤的一个结果，又是心肌损伤进一步发展进而导致心肌机械功能障碍的因素。
心肌缺血再灌注损伤可造成心肌结蛋白的降解，从而改变结蛋白在心肌细胞的分布状况，即原有的均匀分布的模式转变为部分心肌结蛋白减少或缺失，心肌纤维横纹变得模糊不清。结蛋白的降解导致心肌细胞骨架结构遭到破坏。心肌缺血再灌注后心肌结蛋白的上述改变可能是导致的心肌机械功能异常的解剖学基础。
参考文献
[1]李辉，石涵，朱天民，等.红豆杉多糖对犬心肌缺血再灌注损伤模型心肌组织损伤及超微结构的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（1）：219-223.
[2] Sjuve R，Arner A，Li Z，et al.Mechanical alterations in smooth muscle from mice lacking desmin[J].J Muscle Res Cell Motil，1998，19（4）：415-429.
[3] Milner D J，Taffet G E，Wang X，et al.The absence of desmin leads to cardiomyocyte hypertrophy and cardiac dilation with compromised systolic function[J].J Mol Cell Cardiol，1999，31（11）：2063-2076.
[4]陈小波，余祖滨，闵家新，等.大鼠心肌挫伤后细胞结蛋白破坏与钙超载的实验研究[J].第三军医大学学报，2011，33（10）：991-994.
[5]程永生，陈宇，李冬.钙超载及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制研究现状[J].中国医学创新，2013，10（3）：150-151.
[6] Bolli R.Basic and clinical aspects of myocardial stunning[J].Prog Cardiovasc Dis，1998，40（6）：477.
[7] Kloner R A，Bolli R，Marban E，et al.Medical and cellular implications of stunning， hibernation，and preconditioning：An NHLBI workshop[J].Circulation，1998，97（18）：1848-1867.
[8] Braunwald E，Kloner R A.The stunned myocardium：prolonged，postischemic ventricular dysfunction[J].Circulation，1982，66（6）：1146-1149.
[9] Bolli R.Mechanism of myocardial “stunning”[J].Circulation，1990，82（3）：723-738.
[10] Matsumura Y，Saeki E，Inoue M，et al.Inhomogeneous disappearance of myofilament-related cytoskeletal proteins in stunned myocardium of guinea pig[J].Circ Res，1996，79（3）：447-454.
[11] Papp Z，van der Velden J，Stienen G J M.Calpain-I induced alterations in the cytoskeletal structure and impaired mechanical properties of single myocytes of rat heart[J].Cardiovasc Res，2000，45（4）：981-993.