氨肽酶脱苦效果的研究
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摘要：目的研究从豆腐乳中筛选到的一种枯草芽孢杆菌所产的氨肽酶脱除大豆蛋白质水解物苦味的效果。方法 用高效液相色谱法和感官评定。结果1 %的大豆蛋白质溶液经胰蛋白酶水解，水解液呈苦味，添加氨肽酶可较好地脱苦，水解液中游离氨基酸的总量增加了28.8 %，疏水氨基酸的量也明显增加。结论枯草芽孢杆菌氨肽酶具有较好的脱苦效果。
关键词：氨肽酶；大豆蛋白；脱苦
中图分类号：TS201.25文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)11-0036-04
Study on Debittering Effect of Aminopeptidase
XU Ying-min
( Suzhou Polytechnical Institute of Agriculture, Suzhou 215008, China)
Abstract：Objective To Study the debittering effect of aminopeptidase from Bacillus subtilis on soy protein hydrolysate. Methods A HPLC method and organoleptic investigation were used. Results 1% hydrolysate of soy protein with trypsin treatment was bitter. The bitterness could be removed by the addition of aminopeptidase. The amount of free amino acids was increased by 28.8 % and the amount of hydrophobic amino acid was also increased obviously. Conclusion The aminopeptidase from Bacillus subtilis has an ideal debittering effect.
Key words： aminopeptidase; soy protein; debittering
蛋白质是人体必需的营养素之一。蛋白质水解物通常为寡肽、小分子肽和少量氨基酸的混合物[1]，其溶解性、热稳定性较蛋白质有明显改善，具有比蛋白质更好的加工性能和营养特性，是现代食品加工过程中的重要原料。但蛋白质水解液往往呈现苦味，限制了它的实际应用[2]。因此，去除蛋白质水解物的苦味成为研究的重要课题。
蛋白质水解物的苦味主要来自水解物中的苦味肽。苦味肽一般是N端带有单 个或多个疏水氨基酸残基，有时也可能是C端带疏水氨基酸残基。天然蛋白质是无味的，由于天然蛋白质相对分子质量很大，分子构型复杂，其疏水性残基被包裹在分子内部无法与味蕾接触，因而不呈现苦味。蛋白质一旦水解成相对分子质量较低的多肽时，包裹的疏水性残基就会暴露，从而与味蕾接触产生苦味[2]。氨肽酶可从N端切除疏水性氨基酸残基从而达到脱苦的目的[3,4]。国外对微生物源外肽酶研究较早，在20世纪70年代初，Tadanobu等就从米曲霉中提纯了3种亮氨酸氨肽酶及羧肽酶[5,6]，现已有复合型蛋白酶Flavourzyme问世，利用微生物氨肽酶进行蛋白质水解液脱苦的研究也较多[4]。而国内对微生物源氨肽酶的报道较少，脱苦多用Novo公司所产的Flavourzyme。我们选取大豆蛋白质为底物，考察了从豆腐乳中筛选到的枯草芽孢杆菌所产的氨肽酶脱除蛋白质水解物苦味的效果。
1材料与方法
1.1材料
大豆蛋白（生化试剂，上海化学试剂公司）；胰蛋白酶（上海伯奥生物科技有限公司）；氨肽酶（本实验室发酵制备）。
1.2仪器
722分光光度计（上海第三分析仪器厂）；PHS-25型pH计（上海雷磁仪器厂）；TG-328A电光分析天平（梅特勒公司）；安捷伦1100液相色谱仪（美国）。
1.3实验方法
1.3.1蛋白质含量测定Bradford法[7]。
1.3.2DH值（水解度）测定方法采用pH-stat法[8]。DH＝BN/a×m×h，式中 B为消耗碱量，N为氢氧化钠摩尔浓度，a为蛋白质氨基的平均解离度，m为蛋白质的质量数，h为每1 g蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数。
1.3.3氨基氮测定方法茚三酮法[9]。
1.3.4游离氨基酸组成测定使用安捷伦1100液相色谱仪。C18柱4.0 mm×25 mm，紫外检测器，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，波长338 nm、262 nm（Pro），流动相A：20 mmol醋酸钠液，B：20 mmol醋酸钠液∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶2（V/V）。
1.3.5 苦味评价方法称取2 g苦丁茶，加500 mL蒸馏水煮沸30 min，过滤，定容至500 mL。分别稀释20，40，60，80，100倍，定义苦味值为强、较强、中、弱、无。
2结果与讨论
2.1单独使用氨肽酶的水解效果
称取适量大豆蛋白质，溶解于pH 8.5、10 mmol/L的Tris-HCl溶液中，配制成1 %的底物溶液（实际纯蛋白底物浓度为0.92 %），反应温度50 ℃，分别加入不同量（5 000，10 000，20 000 U/g）的试验氨肽酶进行酶解，随着水解的进行，酶解液pH逐渐下降，滴加0.25 mol/L的氢氧化钠保持酶解液pH 8.5左右，记录消耗碱量与时间的关系，换算成水解度DH与时间的关系，见图1。
由图1可见，单用氨肽酶不能彻底水解蛋白质，水解度仅能达到7.3 %，释放的游离氨基酸也有限，所以以下实验都采用双酶法二步水解。
2.2双酶法水解大豆蛋白质
大豆蛋白质溶解于pH 8.0、10 mmol/L的Tris -HCl溶液中，配制成1 %的大豆蛋白质液，85 ℃水浴预处理15 min，水解温度40 ℃，分别加入酶浓度∶底物浓度（E/S）为1/200，1/100，1/50的胰蛋白酶进行酶解，滴加0.25 mol/L的氢氧化钠保持酶解液pH 8.0左右，记录消耗碱量与时间的关系，换算成DH与时间的关系，见图2。
由图2可见，随着酶水解时间的延长和加酶量的增加，大豆蛋白质水解度变化的总趋势是逐渐增加。在水解初期，水解度上升很快，2 h后上升速度逐渐缓慢，3 h后基本保持稳定。当E/S加至1/100时，酶浓度增加对水解度的影响减弱，考虑到成本因素，加酶量以1/100为宜。胰蛋白酶水解4 h后，水解液85 ℃水浴加热15 min灭酶，离心去沉淀，调节pH至氨肽酶最适的 8.5，分别加入不同量的氨肽酶5 000，10 000，15 000，20 000 U/g保持温度50 ℃、pH 8.5不变，继续水解10 h。结果表明，加入氨肽酶后水解液pH变化不大，水解度DH增加了6.73 %。测定水解液中氨基氮的变化，结果见图3。
由图3可见，水解液中的游离氨基酸含量随酶量的增加和时间延长呈现明显上升的趋势，8 h后水解基本完成，游离氨基酸的量不再增加。酶量的添加以10 000 U/g为宜。水解完毕氨基酸含量由2 450 mg/L上升到3 157 mg/L。对胰蛋白酶水解液及双酶水解液进行游离氨基酸分析，结果见表1。
由表1可见，双酶水解后谷氨酸和精氨酸的量增加最为明显，甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和亮氨酸等疏水氨基酸的量也有一定的增加，表明添加氨肽酶起到了增加游离氨基酸数量及脱苦的效果。
2.3氨肽酶对大豆多肽苦味的影响
比较制得的大豆多肽溶液与不同浓度的苦丁茶，得到大豆多肽的苦味值，见表2。
由表2可见，随着酶量增加及水解时间延长，苦味呈下降趋势，加酶量以10 000 U/g为宜，水解完毕苦味值由强降至无，水解液清亮无沉淀，无苦味感。
3结论
枯草芽孢杆菌氨肽酶单一作用不能彻底水解蛋白质。大豆蛋白质经胰蛋白酶单一作用水解，水解度达到10.88%，水解液中游离氨基酸的量为2 450 mg/L，水解液呈现苦味。添加枯草芽孢杆菌氨肽酶进一步水解，游离氨基酸总量增至3 157 mg/L，谷氨酸的增加最为明显，疏水氨基酸的量也明显增加，苦味基本脱除。若对此枯草芽孢杆菌的产酶条件进一步优化，有望实现工业化生产，开发出新型酶制剂，用于肉类、鱼类加工，酱油、酱料等调味料及营养食品、保健食品、蛋白质饮料等大豆肽产品的研制。
参考文献
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[9]管敦仪. 啤酒工业手册[M]. 北京：中国轻工业出版社，1982：190-195.
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