Toll样受体在S180肿瘤细胞上的表达及意义

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【摘要】 目的 通过比较S180肿瘤细胞体内、体外TLRs表达的变化，探讨TLRs 在肿瘤发生、发展中的作用和意义。方法 ①将传代培养的S180腹水癌细胞接种于ICR小鼠腹腔左侧，建立S180腹水癌模型；②采用密度梯度离心法分离纯净肿瘤细胞；③采用半定量RT-PCR方法检测S180腹水癌体外传代培养细胞与荷瘤鼠体内瘤细胞TLR1-9 mRNA表达水平。结果 TLR1、2、4、6在S180腹水癌体外传代培养细胞中表达水平高于荷瘤鼠体内瘤细胞；TLR7体外传代培养细胞中表达水平低于荷瘤鼠体内瘤细胞；TLR5、9体外传代培养细胞中有表达，荷瘤鼠体内瘤细胞无表达；TLR3、8体外传代培养细胞与荷瘤鼠体内瘤细胞均无表达。结论 S180肿瘤细胞可表达TLRs，并且不同的TLRs在体内、体外的表达有所差异，提示TLRs在肿瘤的免疫逃逸中发挥一定的作用。

【关键词】 肿瘤细胞；S180腹水癌；toll样受体

The expression and significance of Toll-like receptor on s180 cellsLIU Huao-Chuan,LIU Bai-nan,LI Xin，LI Yi．1．Seven Years Program of Clinical Medicine,Jilin University,Medical College of Basic Science,Changchun 130021,China;2．Department of Immunology,Jilin University,Medical College of Basic Science,Changchun 130021,China【Abstract】 Objective To study the difference between TLRs expressed on the surface of S180 cells in vitro and in vivo，and investigate the significance of TLRs in the genesis and development of tumor．Methods ①The ascitic S180 models were established by injected subcutaneously to the left abdominal of ICR mice with subculturing ascitic S180 cells．②Separate pure tumor cell with the method of density gradient centrifugation．③The expression of TLR1-9 mRNA were analyzed by semi-quantitative RT-PCR．Results TLR1,2,4,6 expressed more in vitro than in vivo；TLR7 expressed more in vivo；TLR5,9 only expresses in vitro；TLR3,8 neither expressed in vitro nor in vivo．Conclusion TLRs may express on the surface of S180 cells．And the expressions are different between the cells which grew in vitro and in vivo．It suggests that TLRs may play roles in the tumor evasion．

【Key words】 Tumor cell；Ascitic S180；Toll-like receptors（TLRs）

1997年Janeway等首次在人体分离出果蝇Toll的同系物，将其命名为TLR4。随后在人类已发现有11种TLR。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是目前发现能识别病原微生物上的高度保守结构基序―病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的一组跨膜蛋白，属于白介素1受体(IL-1R)超家族成员，TLRs识别的PAMPs是一类高度保守的分子结构，这些分子结构存在于细菌、真菌和病毒。TLRs与PAMPs相互作用启动相应免疫应答[1]在机体的天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。近年来，表达在抗原提呈细胞（antigen presentation cells，APC）的TLRs在肿瘤免疫中的作用越来越引起人们的兴趣，包括通过应用免疫佐剂的作用来增强TLRs识别肿瘤细胞产生的“危险信号”，促进针对肿瘤的免疫应答。

然而近年来，当人们在研究抗原提呈细胞表面TLRs的结构、功能及信号转导途径的同时,却发现多种肿瘤细胞表面也表达多种TLRs,并且与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关。肿瘤细胞在体内的发生与发展是一个与免疫系统相互作用、逃逸免疫监视功能、进而发展为肿瘤的过程。因此，本研究重点通过比较小鼠肿瘤细胞在体内和体外TLRs的表达变化，探讨TLRs在肿瘤发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1．1 动物 ICR小鼠，1只，雌性，体质量18～22g，4～6周龄，由吉林大学实验动物中心提供。

1．2 药品及试剂 IMDM干粉培养基购自GIBCO公司；新生小牛血清购自杭州四季清公司； Trizol试剂购自GIBCO公司；AMV逆转录酶、RNasin与Ex Tag DNA聚合酶均购自TaKaRa公司。

1．3 细胞培养 细胞株由教研室传代保存，S180腹水癌细胞常规培养于含10％小牛血清的IMDM培养液中，置37℃、5％CO2培养箱培养。

1．4 小鼠S180腹水癌模型建立 将制备好的S180腹水癌细胞悬液以0．2 ml/只接种于模型小鼠腹腔（约含活细胞数1．5×106个）；对照小鼠腹腔注射等量的生理盐水。

1．5 观察肿瘤成模情况 观察S180腹水癌小鼠腹腔膨隆情况以判断造模情况。

1．6 S180腹水癌小鼠肿瘤细胞的分离 将小鼠颈椎脱臼处死，常规制备脾细胞悬液。抽取腹水加入预先装有100%，75%ficoll淋巴细胞分离液的试管中，2 000 r/min离心20 min,吸取75%分离液面的细胞即为肿瘤细胞。

1．7 RT-PCR方法检测脾脏和肿瘤细胞TLR mRNA表达 用Trizol试剂提取脾脏组织和肿瘤细胞的总RNA，并进行逆转录反应。cDNA的逆转录采用TaKaRa的AMV RTase，按说明书进行操作。通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。

1．8 RT-PCR产物的检测 取肉汤RT-PCR产物点样在1．5%的琼脂糖凝胶，含0．5 μg/ml溴化乙锭。 5V/cm 进行电泳，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。用Imagemaster VDS(pharmacia biotech)图像分析软件分析光密度值，以TLR/β-actin光密度比值来表示TLR mRNA表达水平，琼脂糖电泳以100bp DNA ladder V(鼎国)以相对分子质量为标准，实验各组RT-PCR扩增的TLR及β-actin条带与相对分子质量标准位置相同。

2 结果

2．1 肿瘤生长情况 我们观察了S180腹水癌小鼠腹腔随着时间发展逐渐增大并伴有腹水的发生，说明S180腹水癌肿瘤造模成功。

2．2 S180腹水癌小鼠脾脏（对照）、体外培养和肿瘤模型鼠癌细胞TLR1-9 mRNA的表达变化 为了研究TLR在S180腹水癌细胞体外培养和肿瘤模型鼠癌细胞表达，我们采用半定量RT-PCR技术检测了TLR1～9 mRNA在S180腹水癌细胞体外培养和肿瘤模型鼠癌细胞表达情况。采用凝胶成像分析系统分析TLR1～9 mRNA表达的水平，结果显示如图1、表1。

结果显示，在S180腹水癌组，TLR1、2、4、6的表达体外培养高于体内生长，TLR5、9体外培养有表达，体内无表达，TLR7则是体内高于体外，而TLR3、8不表达。

3 讨论

研究结果表明小鼠腹水癌体外传代培养细胞表达TLR1、2、4、5、6、7、9，进一步证实肿瘤细胞表达TLR，且可能由于肿瘤细胞的不同而有不同的表达。TLR2的重要配基为肽聚糖（PGN），有实验证明[2]在体外高剂量的PGN刺激下，细胞膜表达TLR2的肿瘤细胞生长受到明显抑制，而细胞膜不表达TLR2的肿瘤细胞生长则不受PGN的影响，产生这种现象的可能原因是PGN激活了肿瘤细胞内的TLR2通路，从而产生多种炎性细胞因子，例如TNF-α、IFN-γ，这些细胞因子共同作用于肿瘤细胞而抑制其增殖，而TLR2可分别和TLR1、TLR6形成异源二聚体进行信号传导。

本实验发现S180腹水癌细胞TLR1、2和TLR6的表达体内均低于体外，提示在体内肿瘤细胞可能通过某些机制降低TLR1、2和6的表达使TNF-α、IFN-γ等细胞因子产生减少从而促进肿瘤的增殖。此外，本实验还发现S180腹水癌细胞TLR4的表达体内也低于体外。有实验表明[3]TLR4可识别OK-432，通过衔接子MyD88激活下游信号通路,最终导致DC的活化,增强抗肿瘤免疫，紫杉醇是一种常用的抗肿瘤药物,近年来人们发现,紫杉醇能够被TLR4识别,最终激活NF-κB,产生多种细胞因子。紫杉醇的抗肿瘤效应可能就是这些细胞因子作用的结果。另外有研究发现肿瘤细胞也表达TLR4[4]，药物在作用于免疫细胞的同时也可以被肿瘤细胞结合，对肿瘤细胞也可能有直接的杀伤作用。

本实验中S180腹水癌细胞TLR4的表达体内低于体外，可能提示在体内肿瘤细胞通过降低TLR4的表达减少对其配体的识别，从而促进肿瘤的增殖。但是，有报道称肿瘤细胞表达TLR4可以促进肿瘤的生长[5]，因此，TLR4在S180腹水癌细胞表达的具体作用有待进一步深入研究。

TLR5识别细菌鞭毛蛋白，有研究发现[6]在肿瘤模型鼠体内加入TLR5的配体鞭毛蛋白后可以减小肿瘤的体积。TLR9识别CpG-DNA，有实验证明[7]促进类浆细胞DC的活化并成熟为专职APC，起到抑制肿瘤生长和杀伤肿瘤细胞的作用。但是TLR5、9在肿瘤细胞上表达的作用仍不明确。本实验中TLR5、9在体外培养有表达，体内生长未检测出表达，可能体内生长的肿瘤细胞通过降低TLR5、9的表达减少TLR5、9配体介导的肿瘤抑制过程。

TLR7识别Imiquimod (咪喹莫特)，有研究报道[8]局部应用咪喹莫特，可以通过DC和炎性细胞表面的TLR7促进获得性免疫应答，从而增强机体对肿瘤细胞的免疫识别。另有文献指出[9]，在血液系统肿瘤中，激动TLR7可加强B系淋巴瘤细胞的免疫原性，减轻淋巴瘤细胞的皮肤损害，在淋巴瘤的免疫治疗中可能发挥一定作用。而有关实体瘤细胞表达TLR7的作用机制尚未见报道。本实验中S180腹水癌细胞TLR7表达体内高于体外，提示肿瘤细胞在体内可能加强了对TLR7配体的识别，而TLR7在S180腹水癌细胞表达的具体作用也有待进一步深入研究。

TLR3可识别poly-IC。有研究表明肿瘤细胞TLR3的表达可诱导肿瘤细胞的凋亡[10]，而肿瘤细胞TLR8的表达与其天然或合成配体结合可逆转调节性T细胞的免疫抑制作用。但本次实验未能检测到TLR3和TLR8在体内外的表达，考虑可能由于肿瘤细胞的不同或实验条件的不同所致，有待进一步深入研究。

通过本实验可以看到，肿瘤细胞普遍表达TLRs，并且不同的TLRs在体内、体外的表达有所差异，提示不同的TLRs在肿瘤发生发展的作用有所不同，这可能为研究肿瘤免疫提供一个新的方向。目前对于TLRs与肿瘤发生发展之间的关系还不十分清楚，而且TLRs的内源性配基也尚不完全明确，肿瘤细胞内是否也存在与APC相似的TLRs下游信号通路也有待进一步证实。

参考文献

1 Kopp E,Medzhitov R．Recognition of microbial infection by Toll like receptors．Curr Opin Immuno1,2003,15(4)：396-401．

2 罗冰,刘艳君,杨翠兰．TLR2在小鼠肿瘤细胞表面的表达．中国实验诊断学,2006,10(11): 1245-1247．

3 Okamoto M，Furuichi S，Nishioka Y．Expression of Toll-like receptor 4 on dendritic cells is significant for anticancer effect of dendritic cells-based immunotherapy in combination with an active component of OK-432,a streptococcal preparation．Cancer Res,2004,64(15): 5461-5470．

4 罗冰,刘艳君,富宁．Toll样受体与肿瘤免疫．中国免疫学杂志，2006,22(10):976-978．

5 Bo Huang,Jie Zhao,Hongxing Li,et al．Toll-like receptor on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance．Cancer Res，2005,65(12):5009-5014．

6 杨昱．Toll样受体5在机体免疫反应中的作用．重庆医学,2006,35(13):1231-1233．

7 Latz E,Sehoenemeyer A,Visintin A．TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome．Nat Immunol,2004,5(2):190-198．

8 Urosevic M,Oberholzer PA,Maier T．Imiquimed treatment induces expression of opioid growth factor reeeptor:a novel tumor antigen induced by interferon-alpha．Clin Cancer Res,2004,10(15):4959-4970．

9 熊芳,王兴兵,张佳华．Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究．中国实验血液学杂志，2007,15(3):449-453．

10 Bruno Salaun,Serge Lebecque,Sampsa Matikainen,et al．Toll-like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy．Clin Cancer Res，2007,13(15):4565-4574．