大鼠肾缺血-再灌注后p38MAPK蛋白表达的变化及银杏达莫注射液对其的影响

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摘 要：目的：探讨银杏达莫注射液对肾缺血-再灌注损伤的保护作用及机制。方法：肾缺血1h再灌注1h建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，用银杏达莫注射液分别按剂量0.9、1.8、3.6mL/kg预处理7天。通过检测肾组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶的活性及血肌酐、血尿素氮的含量。电镜下观察各组肾组织的形态学变化，Western印迹法观察p38 MAPK蛋白的活化情况。结果：缺血再灌注损伤后，肾组织出现明显病理改变，肾组织丙二醛含量升高，超氧化物歧化酶活性下降，血肌酐、尿素氮水平升高，肾组织p- p38mapk蛋白水平显著上升。银杏达莫注射液预处理能降低血肌酐、尿素氮水平及肾组织丙二醛含量，增强超氧化物歧化酶活性和下调p- p38MAPK蛋白水平，与模型组比较有显著性差异（P

关键词：肾；缺血-再灌注损伤；p38MAPK；银杏达莫注射液

中图分类号：R692文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0856-05

Effect of Injection of Ginkgo Biloba Extract and Dipyridamole on

p38MAPK Activation in Rats with Renal Ischemia Reperfusion

LI Dan【sup】2【/sup】,ZHANG Yan-hua【sup】2【/sup】, CHEN Shao-jie【sup】2【/sup】,YU Xu-guang【sup】1 【/sup】，LIN Xiang-dong【sup】1 【/sup】，

TANG Lan-lan【sup】1【/sup】,WANG Shu-jun【sup】2【/sup】,WANG Yuan-yuan【sup】2【/sup】, LI Guan-long【sup】2【/sup】, WANG Wan-tie【sup】2【/sup】

（1. The affiliated Yueqing Hospital, Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，Zhejiang，China；

2. Department of Pathophysiology, Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，Zhejiang，China）

Abstract:Objective：To explore the mechanism of protective effects of Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection （XGD） on renal ischemia-reperfusion injury （RIRI）. Methods：The model of renal ischemia-reperfusion injury in male rats was made by removing the right renal ,and clamping of left renal artery for 1 hour and 1 hour of reperfusion.The rats with pretreatment were fed with XGD respectively at the dosage of 0.9,1.8,3.6mL/kg prior to operation for a week, The content of malondialdehyde （MDA）, the activity of superoxide dismutase （SOD） in renal tissue and the levels of serum creatinine （Scr）, blood urea nitrogen （BUN） were measured. The morphologic changes of renal tissue were observed by electronic microscope. western bloting was used to detect the protein expression and activation.Results：After ischemia-reperfusion,the activity of SOD in renal tissue was decreased,however,the content of MDA and p- p38MAPK protein in renal tissue and the levels of BUN，Cr in plasma were increased. Pathological changes induced by ischemia-reperfusion in renal tissues were observed clearly.The pretreatment of rats with XGD significantly prevented reduction of SOD activity and increasing of MDA content and p- p38MAPK protein in renal tissue,decreased elevation of concentration of BUN and Cr in plasma. Pathological changes of proximal tubullar cells in rat kidneys induced by ischemia-reperfusion were also prevented by the pretreatment with XGD.Different XGD dosage groups showed no significant differences.Conclusion：XGD can protect rats from renal injuries caused by ischemia-reperfusion. The mechanism of protective effects of XGD may be related to preserving the activity of SOD and alleviating lipid peroxidation to reduce the expression of p- p38MAPK protein to improve the ischemia-reperfusion injury in rat kidney function and to reduce the damage.

Key words:KidenyIschemia-reperfusion injury；JNK；Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection

肾脏对缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury）极为敏感。肾移植、严重创伤休克后延迟复苏均会导致不同程度的肾脏IRI【sup】［1-2］【/sup】，肾缺血-再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是发生急性肾衰竭及影响移植存活的重要因素，机制十分复杂。如何采取简便、有效的措施防止因肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病，一直是国内外学者关注的重点、难点和热点。

近年来，有关器官缺血再灌注后细胞内信号通路的变化日益受到重视。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内重要的信号转导系统之一。MAPK家族由3个主要的亚族组成：ERK、JNK/SAPK和p38MAPK。ERKs主要作为细胞促有丝分裂增殖/分化的活化因子；JNK/SAPK和p38MAPK则主要参与细胞凋亡相关蛋白的应激活化【sup】［3］【/sup】。其中p38MAPK主要参与介导应激反应，细胞外多种应激原如放射线、紫外光、热休克、高渗液、促炎因子（如TNF-α,IL-1）等都可激活p38MAPK通路【sup】［4］【/sup】，活化后的p38MAPK以转位的方式进入细胞核，激活其下游的底物，影响细胞的增殖、分化、转化、凋亡等生物效应【sup】［5］【/sup】。银杏达莫注射液（Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection，XGD）是以银杏叶提取物（EGB）为基础的复合制剂，目前已在心脑血管疾病及糖尿病防治中发挥了重要的作用，但在防治RIRI方面的研究尚不多，值得进一步进行实验研究。本实验利用大鼠RIRI模型，观察银杏达莫注射对RIRI的保护作用及其对p38MAPK通路的影响，为临床应用银杏达莫注射液防治RIRI提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 健康雄性Sprague-Dawley大鼠（清洁级），体重200±20g，购自温州医学院实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2005-0019；银杏达莫注射液（山西普德药业有限公司生产，批号：20070601），由乐清市人民医院提供；超氧化物歧化酶（SOD）丙二醛（MDA）尿素氮（BUN）肌酐（Cr）检测试剂盒及蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国MBI公司。

1.2 仪 器 722N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），聚合酶链式反应DNA扩增仪（美国Bio-Rad公司），凝胶定量软件Quantity One（Bio-Rad公司），Image-pro plus 5.0彩色图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），EXL-808酶标仪（美国Bio TeK公司）。

1.3 实验动物分组及方法 50只SD大鼠随机分为3组，每组10只。（1）对照组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）模型组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）银杏达莫注射液处理（高、中、低）组：按0.9、1.8、3.6mL/kg体重尾静脉注射XGD每天1次，连续7天。动物用药量是根据银杏达莫注射液的临床用药，利用大鼠与人的等效剂量换算方法计算得来。

1.4 标本收集 第8天每组大鼠经3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定，作腹部正中3～4cm切口，分离肾周组织，暴露双侧肾脏，游离右侧肾脏结扎肾蒂并摘除右肾。假手术组不做其他特殊处理，模型组和药物处理组先用微动脉夹夹闭左肾蒂缺血1h，然后移去动脉夹再灌注1h建立缺血再灌注损伤模型。全部大鼠都经下腔静脉取血，血液标本用4000r/min高速离心机离心10min，留取上清液进行血肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）检测，取肾组织分别以电镜和生化测定需要（置于液氮或-70℃冰箱中）保存备用。

1.5 MDA含量和SOD活性检测 用冰冷生理盐水做匀浆缓冲液制备肾组织匀浆，羟胺法测定SOD活性，TBA法测定组织MDA含量。按说明书操作实验步骤。

1.6 血清BUN和Cr含量的测定 取动物血清，二乙酰-肟法、苦味酸法分别测定血清BUN、Cr含量。实验步骤按说明书进行。

1.7 电镜检查 取大约1mm【sup】3【/sup】肾上极皮质，用生理盐水冲洗后浸入2.5%戊二醛溶液中固定2h，用生理盐水冲洗3次，再用1%锇酸固定1h。经丙酮梯度脱水，环氧树脂丙酮混合液37℃浸泡24h，纯环氧树脂37℃包埋剂包埋成块，修块定位后，超薄切片（切片厚约1μm-10μm），电子染色，置于H-7500透射电镜下观察。

1.8 肾组织蛋白提取和蛋白印迹法（Western Blot）分析 把肾组织剪切成细小的碎片，取适量已加入PMSF的裂解液（50mM Tris （pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等），匀浆，充分裂解后，12000g离心5min，取上清，用BCA法测定总蛋白浓度后，在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白（80μg总蛋白/泳道），然后转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2h，分别加入p-p38MAPK抗兔多克隆抗体（1∶800）和p38MAPK抗兔多克隆抗体（1∶1000），4℃过夜。次日TBST洗膜后加入抗兔HRP抗体（1∶3000），室温摇床2h，洗膜后ECL发光，在暗室中用X线片显影适当时间，然后冲洗胶片，扫描各种样品的蛋白条带的吸光度（A）值，并分别算出与正常对照组吸光度（A）的比值，以求出其活化倍数。

1.9 统计学处理 两组间比较采用独立样本t检验，数据以±s表示。采用Pearson法分析Cr、BUN、SOD、MDA与p-p38MAPK各参数间的相互关系，所有统计分析均经SPSS 13.0软件处理完成，P

2 结 果

2.1 银杏达莫注射液对大鼠肾组织SOD活性 MDA含量及血清BUN Cr含量的影响 由表1可知，模型组的血清BUN、Cr、组织MDA含量比对照组显著升高，SOD活性比对照组显著降低，银杏达莫处理组血清BUN、Cr、组织MDA含量比对照组明显升高，但显著低于模型组的水平，SOD活性比对照组明显降低，却显著高于模型组。表1 各组大鼠肾组织匀浆SOD活性 MDA含量及血清BUN Cr含量的变化及比较（n10，±s ）

注：与对照组比较:P

2.2 银杏达莫注射液对大鼠肾组织p38MAPK蛋白表达化水平的影响 Western印迹结果表明，与对照组比较，各组大鼠肾组织p38MAPK蛋白表达水平均上调（P

表2 各组大鼠肾组织p-JNK表达的

变化及比较（n10，±s）

注：与对照组比较:P

2.3 肾组织SOD、MDA与p-p38MAPK及p-p38MAPK与血清BUN、Cr各参数间的相互关系 直线相关分析显示：SOD与p-p38MAPK之间呈明显负相关，相关系数r为-0.640，P

2.4 肾组织病理改变 肉眼下：对照组肾皮质髓质颜色正常；模型组肾皮质较苍白，髓质颜色呈暗红色；银杏达莫注射液处理组皮质轻度苍白，髓质可见轻度淤血水肿，而高中低三组剂量之间无明显差异。电镜下：对照组近曲小管线粒体变化不明显,无细胞溶解,足突清晰可见，足细胞未见明显变化（图2、7、12、17）。模型组近曲小管上皮细胞大量溶解，呈现空泡化，产生大量吞饮小泡，形成吞噬体，部分线粒体肿胀，形状不规则，部分线粒体基质浓缩，外腔扩大，嵴稀疏散乱，大量足突融合，部分基底膜增厚不均，出现局灶性隆突，足细胞空泡化，胞核固缩，细胞中线粒体部分肿胀变形，部分基质浓缩（图3、8、13、18）。银杏达莫注射液处理组也出现近曲小管部分上皮细胞溶解，呈现空泡化，有吞饮小泡和吞噬体的产生，部分线粒体肿胀变形，部分线粒体基质浓缩，无外腔扩大，嵴清晰可见，无稀疏散乱等改变，部分足突融合，基底膜基本完整，无变形增厚等改变，足细胞结构完整，足细胞中的线粒体也有部分肿胀变形及基质浓缩改变，但程度都较模型组轻（图4、5、6、9、10、11、14、15、16、19、20、21）。

3 讨 论

肾缺血-再灌注损伤是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素、病理机制非常复杂。RIRI与自由基的产生密切相关【sup】［6-7］【/sup】。研究表明【sup】［8-9］【/sup】，在肾缺血-再灌注过程中产生大量氧自由基（oxygen free radical，OFR），这些自由基攻击生物膜的多元不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，生成脂质过氧化物（lipid peroxidation，LPO），LPO可分解产生丙二醛（malondialdehyde，MDA）。在IRI阶段不仅产生大量氧自由基，而且清除自由基的酶类活性也受到抑制，更加重了大量自由基在体内的蓄积。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是超氧阴离子自由基的清除剂，可抑制自由基引起的脂质过氧化反应。

p38MAPK通路是MAPKs的亚家系，主要在细胞应激（如紫外线照射、高渗、机械应激等）条件下被激活，活化后的p38MAPK以转位的方式进入细胞核，激活其下游的底物。已有研究发现氧自由基参与了p38MAPK的激活【sup】［10］【/sup】，本实验相关分析的结果可知，SOD活性与p-p38MAPK表达存在明显的负相关，而BUN、Cr、MDA含量与p-p38MAPK表达存在明显的正相关，与已有的研究结果相符。而缺血缺氧本身也可以诱导p38MAPK的活化【sup】［11］【/sup】， p38MAPK都对炎症因子、热休克蛋白和ROS介导的细胞应激很敏感【sup】［3］【/sup】，p38MAPK的活化启动了细胞凋亡的发生，进而损伤肾脏的组织结构和功能。本实验发现，大鼠肾缺血-再灌注时p-p38MAPK表达明显上调，同时伴随着肾组织结构的严重损伤和肾功能的不同程度减退；而且p-p38MAPK与BUN、Cr之间呈明显正相关关系，提示p38MAPK的活化介导了RIRI的发生、发展。

银杏达莫注射液的主要有效成分为银杏总黄酮（9.0～11.0mg）及双嘧达莫（3.6～4.4mg），具有拮抗血小板活化因子，抗血栓，扩张血管、增加组织血流量、抗氧化，抗自由基作用，降低血中胆固醇及改善微循环等作用，可以通过扩张肾小球的出球小动脉，改善肾脏的微循环来改善肾脏的缺血缺氧状态。因而可以改善血液流动特性，防止血栓形成，改善组织器官的血供。本研究结果发现：给予银杏达莫注射液3个剂量0.9、1.8、3.6mL/kg治疗后，肾组织MDA浓度降低和SOD活性增强，同时p-p38MAPK蛋白表达下调，肾组织损伤一定程度的减轻及肾功能指标不同程度的改善，而3个剂量组的结果虽有个别指标有差别，但无统计学意义。表明小剂量的银杏达莫注射液就可达到保护肾脏缺血再灌注损伤的作用。同时，实验结果也表明：银杏达莫注射液可通过清除体内氧自由基，降低脂质过氧化反应程度，从而减少p38MAPK蛋白的磷酸化，进而对缺血-再灌注损伤肾发挥一定程度的保护作用。

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