Q—开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞周期与凋亡的影响
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[摘要]目的：探讨Q-开关 Nd：YAG激光不同能量照射黄褐斑动物模型对表皮黑素细胞周期与凋亡的影响。方法：用Q-开关激光不同能量照射黄褐斑动物模型，取表皮黑素细胞进行细胞培养，光学显微镜观察黑素细胞形态学变化，流式细胞仪检测照射后细胞周期与凋亡。结果：软件分析结果显示，除高能高频组外Q-开关Nd：YAG 1064nm 激光第一次照射后即刻各能量密度与频率组黑素细胞形态、细胞周期与凋亡无明显改变。第5次激光照射后即刻，高能高频、高能低频和低能高频组与照射前比较树突数量明显减少和长度明显缩短，S期细胞比率减少，凋亡率显著增加，差异有统计学意义（P0.01）。结论：当激光能量和频率达到一定阈值时能使黑素细胞体积变小、树突数量减少、长度缩短、S期细胞比率减少、凋亡率显著增加。为临床应用Q-开关1064nm Nd：YAG激光治疗色素性疾病提供了实验依据。
[关键词]激光；黑素细胞；细胞周期；细胞凋亡
[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）12-1286-05
通过Q-开关激光技术的应用和选择性光热作用原理的提出，咖啡斑、黄褐斑等色素增加性皮肤病的治疗取得令人满意的疗效[1-2]，现阶段人们对Q开关Nd：YAG 1064nm激光的治疗原理的认识尚仅局限于黑素颗粒对光的选择性吸收，而除此之外对激光照射引起的光生物学作用和细胞凋亡和周期并不清楚。但现己明确两者是密切相关的，阻断细胞增殖周期过程可引起凋亡，而凋亡常伴随有生长阻滞[3]。而临床需要我们对激光照射后黑素细胞周期与凋亡深入研究尤为重要，因此，我们通过实验研究初步探讨Q开关 Nd：YAG激光不同能量照射黄褐斑动物模型对表皮黑素细胞周期与凋亡的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验动物： 根据文献[4]制作慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。
1.1.2主要试剂和仪器：RPMI1640培养基、标准胎牛血清、链霉素青霉素双抗、CT、磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国 GIBCO公司）；HMGS 添加剂（美国Cascade Biologics公司）；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、0.25%胰蛋白酶、左旋多巴（美国Sigma公司）；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒及细胞周期检测试剂盒（美国Bender Medsystems公司），bFGF（珠海东大制药）；转铁蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光纯药株式会社）；ABC试剂盒（博士德）； 酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）；台式微型离心机上海安亭科学仪器厂； CO2培养箱北京利康仪器科技发展有限公司；流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司）
1.2 实验方法
1.2.1 照射方法：取慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只豚鼠皮肤（8cm×8cm）划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1min，每周照射一次，共照射5次。实验设每只豚鼠自身激光术前为对照。
1.2.2 取材方法：分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。
1.2.3 标本的分离和细胞悬液的制备[5-6]：取下的豚鼠皮肤组织用0.05%洗必泰浸泡消毒10 min；生理盐水漂洗数遍，剪成5mm×2mm的小块；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用镊子将表皮与真皮分离；将表皮组织置于0.25%的胰蛋白酶中室温消化10 min；用吸管反复吹打成单细胞；待瓶内液体混浊时加入与胰酶等量的含10%胎牛血清终止消化；100目筛网过滤；吸取细胞悬液于离心管中，1 000r/min 离心10min ；弃上清， 加入RPMI1640培养液重悬细胞，1 000r/min 离心10min；弃上清， 加入黑素细胞培养液（MGM，用RPMI1640培养配制，内含20um/mlbF GF、10%FCS、CT250ng/ml、转铁蛋白10μg/ml、氢化考的松3μg/ml、胰岛素0.15U/ml、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素）培养。吹打成单细胞悬液，计数细胞。
1.2.4 传代培养：将上述制备的细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，调整密度为2×104/cm2，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，24h首次换液，每48h换液1次。当细胞生长至70%～80%融合时进行传代。每一次实验取自同一传代细胞，取对数生长期细胞，常规消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，根据实验需要分别接种于96孔板（密度为2×104/ml，每孔100μl，每组设3个复孔）与直径60mm 培养瓶（密度为1×106/ml），继续培养48h 后以备下列实验所用。
1.2.5 L-Dopa染色鉴定与黑素细胞数量和树突长度的测定[7]：取对数生长期培养的黑素细胞用2%多聚甲醛室温固定15min后双蒸水清洗3次，最后每孔加入150μl 0.1% 的DOPA溶液，37℃孵育5h后用连接数字成像系统的倒置显微镜观测，计数每个培养孔中DOPA阳性细胞的总数。运用成像系统计数每个黑素细胞的树突数量，规定树突的一级结构是与细胞体相连，二级结构与一级结构相连，以此类推。每单个树突的长度用Axiovisim4.0软件进行测量，结果分别以平均每单个DOPA阳性细胞的树突数量和长度表示。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡：取接种于培养瓶中的黑素细胞，用0.25%不含EDTA 的胰酶消化制成细胞悬液，900rpm 离心5min，PBS 洗涤二次，计数细胞，调整细胞浓度每样0.1ml 含（1～5）×106个细胞。周期分析采用PI单染，将收集好的细胞加入2ml 75%的酒精固定2h，离心弃上清，PBS 洗涤二次，10mg/L的PI溶液重悬细胞，常温孵育30min 后进行检测。采用AnnexinV-FITC 和碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡，收集细胞后用400μl Binding Buffer悬浮细胞依次加入各10μl AnnexinV-FITC 和PI 混匀，室温避光反应10min 后上机进行检测，每一实验重复3 次，设立治疗前组为阴性对照，用Elite 软件进行分析。
1.3 数据统计分析：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P
2 结果
2.1 L-Dopa染色鉴定与黑素细胞数量和树突长度的测定：激光照射前可见细胞质及树突呈棕褐色或黑色，多巴染色结果呈阳性。软件分析结果显示，各组Q开关Nd：YAG 1064 nm 激光第一次照射后即刻高能高频组与照射前相比多巴阳性细胞数、树突长度和数量轻微减少，差异均有统计学意义（P0.05）； 第5次激光照射后即刻，高能高频和高能低频照射组与照射前相比多巴阳性细胞数、树突长度和数量明显减少，差异显著有统计学意义（P
2.2 Q开关 Nd：YAG1064nm激光照射对豚鼠表皮黑素细胞凋亡的影响：流式细胞仪结果显示，Q开关Nd：YAG1064nm激光不同能量和频率组第一次照射后即刻高能高频组细胞凋亡率为（4.43%±0.75%），与对照组（3.65%±0.29%）相比细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P0.05）。第5次照射后即刻高能量高低频两组和低能高频组细胞凋亡率显著增加（25.47%±0.43%、23.98%±0.54%、21.67%±1.37%），差异有统计学意义（P
2.2 Q开关 Nd： YAG1064nm激光照射对豚鼠表皮黑素细胞周期的影响：流式细胞仪结果显示，Q开关Nd：YAG1064nm激光不同能量和频率组照射后，第1次照射后即刻高能量高低频两组DNA合成期的细胞数比率分别为（36.30%±0.25%、39.92%±0.42%）与对照组（42.21%±0.30%）相比轻度减少（P0.05）。第5次照射后即刻高能量高低频两组和低能高频组DNA合成期的细胞数比率明显减少（23.60%±0.29%、28.23%±0.35%、36.25%±0.30%），术后1周更加显著。低能低频组经5次照射后无明显变化（P>0.05）。照射后3周与照射后1周相比DNA合成期的细胞数比率增加，差异有统计学意义（P
3 讨论
皮肤的色素沉着过程不仅需要黑素细胞胞浆内黑素体合成黑素，同时需要成熟的黑素体通过树枝突转输到周围的角质形成细胞，进入角质形成细胞的黑素体的质与量决定皮肤颜色的差异。因此黑素小体向角质形成细胞内的传递也同样起到了非常重要的作用[8-9]。树突是黑素细胞的重要形态学标志，树突的形态与长短都将直接影响着黑素小体的转运。为确保黑素小体的运动与传递，有效的树突形成是必须的前提条件。树突越长越多，向周围角质形成细胞传递的黑素则越多。黑素细胞形态学的观察表明：Q开关Nd：YAG 1064 nm 激光第一次照射后即刻高能高频组多巴阳性细胞数、树突长度和数量减少。说明单次激光能量密度达到一定阈值时，可以抑制黑素小体的运动与传递。通过5次激光照射后，高能低频和低能高频组照射组多巴阳性细胞数、树突长度和数量减少。但低能高频组多巴阳性细胞数教高能量两组轻微减少。由此可以推测，激光同能量不同频率对黑素细胞的影响也不一样。并且激光低能量累加到一定阈值时，同样也能抑制黑素小体的运动与传递。而且激光低能量对黑素细胞本身的损伤小于高能量。提示我们临床中对于色素细胞活性增强性皮肤病可以使用低能量多次治疗，避免高能量对黑素细胞的损伤。激光照射后三周，高能高频组、高能低频和低能高频组黑素细胞较第5次激光照射后一周体积变大，树突长度和数量增加。说明激光对黑素细胞的抑制作用不是持续性的，会在一段时间后恢复。也许 这就解释了为什么激光术后会出现反跳和复发的现象。同时也说明了激光对黑素细胞的影响是可逆的，为我们激光术后色素减退的治疗提供了可能性的支持。
大量学者研究表明激光照射对人表皮黑素细胞可能存在着光生物调节和生物刺激作用[10-11]，目前，对激光的生物刺激作用一直都没有合理的解释。但激光照射不仅可以引起细胞的凋亡，同时还可使细胞周期出现阻滞的不同变化。细胞凋亡和周期结果显示，Q开关Nd：YAG1064nm激光不同能量和频率组照射后，高能高频组、高能低能组和低能高频组明显抑制黑素细胞 DNA 的合成并促进其凋亡。流式数据分析图显示高能高频组右上象限坏死细胞增多，说明激光高能量高频率超过黑素细胞耐受阈值时直接导致黑素细胞的死亡。而坏死细胞随着能量和频率降低而减少。曾有学者认为[12]，色素脱失主要是由于黑素细胞的缺失，而不仅仅是黑素细胞功能的障碍，引起黑素细胞丢失的原因可能是凋亡增加。使我们猜想激光术后色素减退是否因为细胞凋亡导致。具体机制需要进一步证实。Chan等[13]通过动物实验已经证实重复高能量激光照射可以使细胞DNA 受到损伤。该实验也表明高能高频照射使黑素细胞 DNA 的合成出现阻滞，并且低能高频激光通过次数累加也可以抑制黑素细胞 DNA 的合成。我们已知UVB 对黑素细胞的直接作用主要通过细胞膜上的光受体激活第二信使而起作用[14]，Q开关 Nd：YAG 1064 nm 激光照射光生物学效应作用的分子机制是什么，都需要更多更为深入的实验研究来解决。
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[收稿日期]2013-04-25 [修回日期]2013-06-14