氡及其子体诱发大鼠体细胞HPRT基因位点的突变
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摘要： ［目的］ 用多核细胞法研究氡及其子体诱发大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hprt）基因位点突变情况。 ［方法］ Wistar雄性大鼠24只，采用HD-3型多功能移动式氡室进行动态吸入染毒，按照氡染毒的累计暴露量，分为3个实验组和1个对照组；获取大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞，以多核细胞法检测该两种细胞的HPRT基因突变频率。 ［结果］ 大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变频率均随氡累积暴露剂量的增加而相应增加，剂量-效应关系明显，拟合的函数分别为yˆ = 1.785×10-5D2 + 1.174×10-3D + 1.054和yˆ = 3.538×10-5D2 + 8.338×10-4D + 1.032。 ［结论］ 氡及其子体能诱发大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变，呈现一定的剂量-效应关系。
关键词：氡及其子体；外周血淋巴细胞；气管-支气管上皮细胞；HPRT基因位点突变
Measuring the HPRT Gene Mutation in Rat after Exposure to Radon and Its DaughtersCUI Feng-mei，NING Ping，DUAN Rong-fang，Tong Jian*（School of Radiation Medicine and Public Health，Soochow University，Suzhou 215123，China）
Abstract：［Objective］ The HPRT gene mutation was studied in rat after inhaling radon and its daughters using the multinucleated cells method. ［Methods］ 24 Wistar male rats were divided into 4 groups evenly by random. When the accumulated dose of Radon and its daughters reached to the expected dose，the rats were anesthetized to get the peripheral blood lymphocytes and trachea-bronchia epithelial cells. The HPRT gene mutation test was performed using the multinucleated cells method. ［Results］ The results of the HPRT gene test indicated that the mutation frequencies（MFs）of HPRT gene of the peripheral blood lymphocytes and trachea-bronchia epithelial cells of Radon inhaled groups were all higher than the control respectively（P < 0.05）. Correlation assay showed there have no correlation between the trachea-bronchia epithelial cells and peripheral blood lymphocytes on MFs-HPRT（P > 0.05）. ［Conclusion］ Radon could cause increasing of MFs-HPRT in rat peripheral blood lymphocytes and trachea-bronchial epithelial cells.
Key Words：radon and its daughters；peripheral blood lymphocyte；trachea-bronchial epithelial cell；HPRT gene locus mutation
近年来，居室和职业氡暴露造成的危害不断引起各方的关注，并成为研究的热点。在对氡暴露进行危险度评价时，利用生物样品和生物指标进行剂量估算具有重要的实际意义。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transgerase，HPRT）基因位点突变分析是一种潜在的辐射生物剂量计，常用的检测方法是多核细胞法［1］。本实验通过检测氡及其子体诱发的大鼠外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因位点突变频率，拟合剂量效应曲线，为HPRT基因位点突变作为氡暴露的辐射生物剂量计提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细胞松弛素-B（Cyt-B）、6-巯基鸟嘌呤（6-TG），美国Sigma化学公司产品；RPMI 1640培养基，美国GIBCO公司产品；植物血凝素（PHA）由广州医药工业研究所购入。链酶蛋白酶、牛垂体提取物、牛血清白蛋白、磷酸乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松均为Sigma 产品，丙酮酸钠由苏州大学设备处领取。Ham’s F12 培养基系Gibco 产品。其余所需试剂见参考文献［1］。
1.2 动物染毒
实验用Wistar雄性大鼠24只，7～8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2003-0003。采用HD-3型多功能移动式氡室，大鼠染毒方式为动态吸入。氡室平衡氡浓度约为100 000 Bq/m3。按照氡染毒的累计暴露量，分为60、90、120工作水平月（working level month，WLM）3组和1个对照组，共4组。每组6只动物。染毒时间每天8 h，每周6 d，染毒期间动物自由活动、饮食。1 WLM相当于在一个工作水平（1 WL）下照射一个月的参考工作时间，是个体所受222Rn短寿命子体α潜能照射量的单位。60、90、120工作水平月分别相当于人300、450、600 mSv的辐射剂量。
1.3 大鼠外周血淋巴细胞HPRT基因位点突变频率的检测
1.3.1 血样处理及HPRT基因突变频率的检测 实验组及对照组大鼠，3.6%水合氯醛麻醉后，心脏穿刺取血，每鼠分别取抗凝血1.5 ml于离心管中，加Hank's液8 ml混匀后1 500 r/min离心10 min，弃上清液，重复洗涤一次。将沉积血细胞悬浮于生长培养基（内含90 % RPMI 1 640，10 %灭活小牛血清、庆大霉素及PHA适量）中至体积1.5 ml，取0.5 ml接种于4.5 ml生长培养基中。每个样本培养2瓶，其中1瓶加入6-TG ，终浓度为1×10-5 mol/L，置于（38±0.3）℃，5% CO2培养箱中培养56 h，加入Cyt-B，终浓度为6 μg/ml，再继续培养40 h。收集培养物，离心，固定，制片。
1.3.2 HPRT基因突变频率的计算 每个样本计数2 000个转化淋巴细胞（其中加与不加6-TG各计数1 000个）中的双核或多核淋巴细胞数。将含6-TG的1 000个转化淋巴细胞中双核或多核细胞数除以不含6-TG的1 000个转化淋巴细胞中双核或多核细胞数，所得结果为HPRT基因位点突变频率（MFs，‰）。
1.4 大鼠气管-支气管上皮细胞HPRT基因位点突变频率的检测
1.4.1 大鼠气管-支气管上皮细胞的分离与培养 大鼠麻醉后，无菌条件下暴露气管和肺，环状软骨下方插管，生理盐水灌洗3 次，下端在左右肺门处结扎，去除肺组织，然后灌入1 %链酶蛋白酶，结扎上端，4 ℃过夜，置于90 mm培养皿中，用Ham’sF12 培养基冲洗气管-支气管，再剪开气管-支气管，用细胞刷充分刷洗，4 号针头收集培养皿中的刷洗液，离心洗涤收集细胞。详见参考文献［2］。
1.4.2 HPRT基因突变频率的检测 收集上述得到的大鼠气管-支气管上皮细胞，制成细胞悬液，以1×105个细胞/ml接种于无血清完全F12培养基中，每个样本接种2个培养皿，于其中一个培养皿中加入6-TG ，终浓度为1×10-5 mol/L，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养56 h，加入Cyt-B，终浓度为6 μg/ml，再继续培养40 h。弃培养液，收集贴壁细胞，离心，固定，制片。
1.4.3 HPRT基因突变频率的计算 同“1.3.2”。
1.5 统计分析
不同剂量诱发HPRT基因突变率间的比较采用秩和检验法，并拟合剂量-效应关系函数。
2 结果
2.1 氡及其子体诱发大鼠外周血淋巴细胞的HPRT基因突变频率
表1结果表明，随着氡累积暴露剂量的增加，大鼠外周血淋巴细胞的HPRT基因突变频率相应增加，当暴露量达到90 WLM时，与对照组比较，差异有显著性。根据淋巴细胞HPRT基因突变频率y（‰）与累积剂量D（WLM）拟合的函数为yˆ = 1.785×10-5D2 + 1.174×10-3D + 1.054，R2 = 0.881 4。
2.2 氡及其子体诱发大鼠气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变频率
表2可见，氡及其子体诱发的气管-支气管上皮细胞HPRT基因突变率随累积剂量的增加而增加，暴露量达到60 WLM时，与对照组比较，差异已有显著性。根据气管-支气管上皮细胞HPRT基因突变频率y（‰）与累积剂量D（WLM）拟合的函数为yˆ = 3.538×10-5D2 + 8.338×10-4D + 1.032，R2 = 0.920 8。
2.3 氡及其子体诱发的大鼠气管-支气管上皮细胞与外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率的相关性分析
相关性分析表明，氡暴露后大鼠气管-支气管上皮细胞与外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率之间无相关（P > 0.05）。
3 讨论
在对氡暴露进行危险评价时，氡及其子体的累积剂量估算是一个重要的参数。常用的方法是将暴露环境中氡子体的浓度与该浓度下累积的暴露时间相乘，得到累积照射量。但是，对职业受照者，在剂量检测资料不完备、工作地点不固定、岗位和工种缺乏按时准确登记以及劳动条件、防护条件和个体差异等因素的影响下，用上述方法会遇到一些困难，从而造成估算结果的偏差。对于居室环境，由于没有常规监测资料，更是无法进行估算。因此，利用生物样品和生物指标来估算累积剂量有可能成为一种替代的方法。
有关辐射诱发HPRT基因位点突变的报道很多，集中在原爆幸存者［3］、放疗患者［4，5］、事故性受照者［1，6］及大量的实验研究［7-9］。HPRT基因位点对电离辐射敏感，而且其突变是不可逆的，可以在体内累积，同时具有良好的剂量效应关系，因而适用于急性及慢性小剂量长期照射，特别是长期小剂量暴露人群的基因位点突变检测。O’NEILL等人研究了人G0期T淋巴细胞受到137Cs低传能线密度（linear energy transfer，LET）照射和222Rn高LET照射后的基因效应，发现这两种类型的辐射都能诱发HPRT基因突变，并且有剂量依赖关系，拟合的函数方程分别为：突变率（MFs）= 4.28 + 1.34D + 7.51D2（R2 = 0.95）和突变率（MFs）= 4.81 + 0.67D（R2 = 0.51）［10］。
本实验选取外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞为观察对象。外周血淋巴细胞是常用且易得的生物样品，而气管-支气管上皮细胞是氡及其子体的靶细胞。检测结果表明，随着氡累积暴露量的增加，外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变频率均相应增加，有明显的剂量-效应关系，拟合的函数方程yˆ = 1.785×10-5D2 + 1.174×10-3D + 1.054和yˆ = 3.538×10-5D2 + 8.338×10-4D + 1.032 均为直线平方模型，与文献［10］报道的直线平方模型不同，但更能反映本实验的结果。对外周血淋巴细胞和气管-支气管上皮细胞的HPRT基因位点突变的相关性分析表明，二者无相关关系，外周血淋巴细胞的HPRT基因突变并不能反映气管-支气管上皮细胞的HPRT基因突变情况。
在以往的实验研究中，也得到了氡及其子体能诱发HPRT基因位点突变频率增加的肯定性结论［11］。但对居室氡暴露与HPRT基因突变频率之间关系的研究，并不支持居室氡暴露增加HPRT基因突变频率增加的假说［12］。因此，HPRT基因突变作为长期低剂量氡暴露的生物剂量计仍需进一步加以研究。
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（收稿日期：2006-08-31）
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