骨关节炎软骨潮线漂移与软骨退变的相关性研究
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【摘 要】目的：探讨骨关节炎软骨潮线漂移与软骨退变的相关性。方法：选取8周龄SD大鼠20只，随机分为正常组和造模组，每组10只。采用4%木瓜蛋白酶双膝关节腔注射复制骨关节炎模型，8周后取双侧膝关节常规固定、脱钙、包埋和切片，分别采用苏木精-伊红、番红O-固绿、甲苯胺蓝和Masson三色染色法，观察骨关节的组织形态学变化。结果：正常关节面光滑平整，细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整呈波伏浪起的曲线，软骨下骨小梁排列规律；骨关节炎关节面粗糙变形，细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断，软骨下骨硬化或囊变。结论：软骨潮线漂移是骨关节炎软骨退变进程中必经的病理变化。
【关键词】 骨关节炎；软骨；潮线；软骨退变；软骨下骨；相关性；大鼠
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.01.002
Correlation Study of Cartilage Tidal Line Drift and Degradation in Osteoarthritis
LI Xi-hai，LIANG Wen-na，YE Hong-zhi，LIU Fa-yuan，LI Hui-ting，ZHENG Chun-song，WU Guang-wen，
XU Hui-feng，CHEN Wen-lie， LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the correlation between cartilage tidal line drift and degeneration in osteoarthritis.Methods：20 SD rats of 8 weeks old were randomly and equally divided into the normal group and the model group.Injections of 4% papain were given to their double knee joint cavities to replicate the osteoarthritis models.After 8 weeks，the bilateral knee joints of the rats were taken conventionally，fixed，decalcified，embedded and sliced，respectively using hematoxylin-eosin，safranin O-fast green，toluidine blue and Masson trichrome staining，observing the osteoarticular histological changes.Results：The normal joints characterized smooth articular surface，cells arranging in neat rows，four-layer structure being clear，tidal lines being complete wavy and subchondral bone trabeculas being regular； but the joints with osteoarthritis characterized deformed and rough articular surface，cells arranging in disorder，the four-layer structure being not clear，multiple tidal lines or interrupted tide lines being visible and subchondral bone trabeculas being sclerotic and cystic.Conclusion：Cartilage tidal line drift is the necessary pathological changes in the process of cartilage degeneration in osteoarthritis.
【Keywords】 osteoarthritis；cartilage；tidal line；cartilage degeneration；subchondral bone；relevance；rats
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性、进行性关节疾病，在生物学和力学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[1-2]。目前，OA研究主要集中在软骨退变方面，而软骨潮线漂移研究相对较少。软骨潮线漂移引起软骨下骨重建异常，导致软骨下骨生物力学改变，降低对关节软骨保护能力，从而引发软骨退变[3]。本文旨在通过观察软骨潮线漂移与软骨退变的关系，探讨软骨潮线漂移在骨关节炎病理进程中的作用。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级8周龄SD大鼠20只，雄性，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。医学实验动物环境设施为福建中医学院动物实验中心鼠类实验室，清洁级（合格证号：医动学第23-016号）。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 药品与试剂 10%水合氯醛，批号SF0341，上海士锋生物科技有限公司生产；4%木瓜蛋白酶，批号107147，sigma公司生产；苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE），批号G1120，北京索莱宝科技有限公司生产；番红O-固绿，批号DB0082，北京雷根生物技术有限公司生产；甲苯胺蓝，批号198161，sigma公司生产；Masson三色，批号C0620，百浩生物生物科技有限公司生产。
2 方 法
2.1 实验方法 采用抽签法将SD大鼠随机分为正常组和模型组，每组10只。模型组第1，4，7天，用10%水合氯醛3 mL・kg-1腹腔麻醉，4%木瓜蛋白酶0.2 mL双膝关节腔注射建立骨关节炎模型[4]，
8周后，取双侧膝关节股骨髁（0.4 cm×0.3 cm×
0.2 cm）常规固定、脱钙、包埋和切片，分别采用HE、番红O-固绿、甲苯胺蓝和Masson三色染色法，观察关节软骨组织形态的变化。参考Mankin's骨关节炎组织学分级方法进行评分[5]。
2.2 检测方法
2.2.1 HE染色 切片常规脱蜡，苏木精染液4 min，
1%盐酸酒精分化液分色10 s，伊红染液3 min，脱水透明封片。HE染色观察软骨组织结构、软骨细胞与软骨下骨的变化。
2.2.2 番红O-固绿染色 切片常规脱蜡，新鲜配制的试剂（A）即Weigert苏木素染液染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，蒸馏水洗1 min， 固绿染色液内浸染5 min，蒸馏水洗1 min，番红 O染色液内浸染 2 min，蒸馏水洗1 min，用乙酸溶液洗涤切片1 min，脱水透明封片。番红O-固绿染色观察蛋白聚糖的变化。
2.2.3 甲苯胺蓝染色 切片常规脱蜡，0.1%甲苯胺蓝溶液10 min，蒸馏水稍洗，快速95%与100%乙醇脱水，二甲苯透明和封固。甲苯胺蓝观察蛋白多糖的变化。
2.2.4 Masson三色染色 切片常规脱蜡，Weigert苏木素A和Weigert苏木素B等比混合，染色10 min，
蒸馏水洗1 min，Masson复合染色液染色15 min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸液处理5 min，苯胺蓝染色液复染5 min，1%冰醋酸水处理1 min，脱水透明封片。Masson 三染色观察软骨基质胶原的变化。
2.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以表示，采用one-way ANOVA分析；计量资料采用Logistic回归分析Chi-square tests。
3 结 果
3.1 骨关节炎退变软骨的组织形态 正常组软骨细胞核呈深蓝色，胞浆及软骨基质呈粉红色，着色均匀；软骨表面光滑平整，表层细胞较小呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层软骨细胞较大呈椭圆形或圆形，同源细胞群分布散在；放射层软骨细胞较大单个或趋于柱状排列，分布散在。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整。软骨下骨致密层厚度适中，松质层骨小梁密度和宽度适中，排列规律，骨细胞呈梭形，分布均匀，骨基质均匀红染。图1（1）。模型组软骨表面粗糙，完整性破坏，表层软骨出现纤维化变性及软骨缺损，甚至软骨下骨，软骨细胞出现簇集现象，或肥大软骨细胞增多，可见较多空软骨陷窝。细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断。软骨下骨致密层变薄，骨松质层骨小梁稀疏，硬化或囊变，边缘有丘状隆起的骨赘。图1（2）。正常组与模型组的干骺端组织形态结构未见明显异常，图1（3）、1（4）。
图1 关节软骨与干骺的形态学观察（HE染色×40）
3.2 骨关节炎软骨基质的蛋白多糖含量减少和纤维变性 番红O与固绿染色分别染色，软骨与软骨下骨染色均匀，不能区分各组织的层次结构，图 2、图3。正常组软骨基质中蛋白多糖红染均匀，胶原纤维呈绿色，潮线清晰，软骨下骨皮质和骨小梁呈绿色，软骨与软骨下骨界限清楚，图4（1）。模型组软骨基质中蛋白多糖染色较淡，染色范围小，而绿色范围增大，由软骨表层和放射层向中间延伸，软骨表面的膜样结构破坏，图4（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖与胶原纤维表达未见明显异常。图4（3）、4（4）。
甲苯胺蓝染色，正常组软骨细胞核呈蓝色，软骨基质中的蛋白多糖异染呈紫蓝色，染色深且阳性面积范围大，软骨下骨基质染色很淡，图5（1）。模型组软骨基质染色的深度和面积都明显下降。图5（2）。正常组与模型组的干骺端蛋白多糖表达，未见明显异常，图5（3）、5（4）。
Masson三色染色，正常组软骨基质和胶原纤维呈绿色，着色均匀，向钙化层方向染色逐渐加深，潮线清晰，软骨和软骨下骨边界清晰，软骨下骨的密质骨及骨小梁呈绿色，骨胶原呈红色，图6（1）。模型组软骨失染，有裂隙，纤维化明显，潮线附件有大量火焰状升起的深色红染，升起较高，范围较大，软骨和软骨下骨边界不清晰，图6（2）。正常组与模型组的干骺端胶原纤维表达未见明显异常，图6（3）、6（4）。
3.3 OA软骨退变的程度 Mankin's软骨组织形态学的分级标准，根据软骨退变程度计分，表层软骨细胞分裂增生（0～3分）、细胞排列（0～3分）、潮线（0～3分）、血管翳样物生成（0～3分）、AB-PAS染色（0～4分），最高为16分，是判断骨关节炎软骨退变的常用方法之一。关节软骨Mankin's评分，模型组（10.25±2.68）明显高于正常组（1.17±0.61）（P < 0.01），图7。正常组软骨潮线清晰，呈波浪起伏的曲线，模型组均出现软骨潮线紊乱，Logistic回归分析Chi-square tests显示软骨潮线变化与骨关节炎的发生发展密切相关（P < 0.01）。
正常组 模型组
图7 关节软骨Mankin's评分
注 1）P < 0.01
4 讨 论
OA本质上可能是一种生物学的重建过程，是多种生物因素与机械损伤因素相互作用所致生物力学紊乱而引起的病理改变。OA的发病率随着人口老龄化逐渐增加，已成为严重的公共健康问题。目前，OA发病的分子机制尚不清楚，且缺乏有效治疗方法，故OA的发病机制和防治是临床和基础研究的热点问题。OA动物模型的建立是研究OA发病机制及防治的常用方法，通过观察关节软骨的组织形态学，探讨动物模型的成功与否及防治疗效，为OA的深入研究提供了一个有效的技术平台。
关节软骨由软骨细胞和软骨基质组成，在生理条件下，软骨基质成分的分解与合成之间保持动态平衡。软骨细胞是软骨中唯一细胞类型，也是调节软骨代谢反应的主要来源，软骨细胞能感受细胞外基质微环境的变化并做出相应的反应，以维持基质成分分解与合成代谢的平衡，保持关节软骨的正常生理功能[6]。胶原和蛋白多糖是软骨细胞外基质的主要成分，软骨基质中的胶原以Ⅱ型胶原为主，是软骨基质的特征性胶原成分，构成软骨内的纤维网架结构；蛋白多糖由不同分支状的多糖聚合体组成，能吸引大量的水分子形成凝胶，保持软骨的良好弹性和膨胀能力。OA患者软骨基质结构发生破坏，以蛋白多糖和Ⅱ型胶原的破坏为主，出现胶原的变性、裂解、破坏、减少及晚期胶原纤维网架的消失，蛋白多糖含量下降，进而引起软骨细胞功能改变，基质成分分泌减少，从而加速软骨退变。软骨下骨由软骨下骨板及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙构成，是关节软骨的重要功能单位，对软骨起到机械性和代谢性的保护作用[7]。OA的病理过程中，软骨下骨发生骨塑形重建的方式是直接在关节软骨负重面的下方，或在关节的边缘，形成OA的骨赘[8]。在骨重建过程中，骨形成与骨吸收相耦联，成骨和破骨在同一部位有序进行，OA早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导，后期则骨形成为主，从而导致软骨下骨硬化[9-10]。
潮线位于软骨放射层与钙化层的连接部，呈波浪起伏的曲线，具有防止软骨钙化的作用，属于放射软骨层的组成部分，潮线上下的胶原纤维是连接的，有利于放射层软骨的胶原纤维牢固地附着在钙化软骨层的髓腔层，并且有密集的胶原纤维平布潮线的表面，以对抗剪应力和限制软骨钙化[11-12]。潮线在关节软骨钙化过程中发挥重要的调控作用，虽软骨潮线漂移与软骨下骨变化的因果关系尚不确定，但软骨潮线漂移程度与软骨下骨变化存在一定的相关性，在OA软骨退变病理过程中发挥重要的调控作用。
HE染色法是依据苏木素的嗜酸性及伊红的嗜碱性特点，苏木素染组织中酸性成分（如核酸）呈蓝色，而伊红染组织中碱性成分（如蛋白质）呈红色，从而显示组织的形态结构[13]。HE染色法显示，OA的软骨层破坏，层次结构紊乱，软骨细胞凋亡，潮线漂移；软骨下骨硬化及囊变的病理现象。但HE染色的骨关节组织，软骨和软骨下骨的界限不清晰，也难以特异显示软骨基质的病变情况，可结合特殊染色法以弥补常规染色的不足。因此，本研究采用特殊染色法（番红O-固绿、甲苯胺蓝及Masson三色染色法）观察OA的蛋白多糖和胶原纤维的变化。
番红O-固绿染色法是OA组织形态研究的常用特殊染色法，番红O是一种碱性染料，即阳离子染料，能与酸性蛋白多糖（含阴离子）结合呈红色，染色强度曲线与软骨基质中固定电荷的密度曲线呈线性关系，可以通过图像分析系统进行半定量分析软骨基质中的蛋白多糖；固绿是酸性染料，与富含碱性氨基酸的胶原结合呈绿色，具有衬染的作用[14]。实验结果显示，番红O-固绿染色法能清晰区分软骨和软骨下骨，也能清晰地显示软骨潮线，可以用于观察软骨组织的层次结构及软骨厚度的形态计量学。甲苯胺蓝染色法是骨关节染色研究中的常用方法之一，常用于培养软骨细胞的鉴定及软骨蛋白多糖的半定量分析，甲苯胺蓝是一种碱性染料，与软骨基质中酸性蛋白多糖异染呈紫蓝色，其原理是糖蛋白上的酸性基团与甲苯胺蓝的阳离子结合时，染料分子发生聚合反应，导致吸收光谱的改变出现异染。实验结果显示，甲苯胺蓝染色法可清晰区分关节软骨与软骨下骨界限，潮线结构的显示亦可，而软骨下骨的形态结构不能清晰显示。
Masson三色染色法由Mallory三色染色改造，主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色，利用2种或3种阴离子染料混合一起或先后作用完成染色，与组织的渗透性和阴离子染料分子的大小有关。根据组织的渗透性能不同，选择分子大小不同的阴离子染料进行染色，胶原纤维、软骨与粘液呈蓝色，肌纤维、纤维素及红细胞呈红色，细胞核呈蓝黑色[15]。
Masson三色染色法可清晰显示软骨的各层结构，软骨和软骨下骨的界限显示不够清晰；胶原纤维分为多种类型，骨组织以Ⅰ型胶原为主，软骨以Ⅱ型胶原为主，且OA病理过程中软骨细胞的表型和胶原纤维的类型发生转化，而Masson三色染色法使所有的胶原纤维呈同一种颜色，不能区分胶原纤维的变性，可采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学法观察关节软骨和软骨下骨胶原成分的变化。
通过染色观察，HE染色显示模型组软骨破坏严重，同时伴有潮线紊乱、软骨下骨硬化或囊变、关节边缘骨赘，提示软骨潮线漂移与软骨退变有一定的相关性。番红O-固绿染色与甲苯胺蓝染色结果显示，模型组蛋白多糖失染明显；Masson三色染色显示模型组软骨绿色丢失程度明显，且染色同软骨下骨及骨小梁胶原，提示OA病理进程中，软骨基质中胶原和蛋白多糖的含量减少及胶原类型的转变。Mankin's评分结果显示，OA组明显高于正常组，表明本实验造模方法能较好的建立膝OA的动物模型。
综上所述，软骨潮线漂移是OA软骨退变进程中必经的病理变化，参与软骨基质代谢及软骨下骨重建的调节过程。HE染色、番红O-固绿染色、甲苯胺蓝染色与Masson三色染色均能清晰观察关节软骨的组织形态结构，但各种方法所显示组织形态结构的部分不同，可根据实验设计的目的不同，选择不同染色方法，为OA关节软骨染色方法的选择提供参考依据。
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收稿日期：2013-09-18；修回日期：2013-11-18