五种钝齿棒杆菌噬菌体的分纯及鉴定

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【摘要】 从某味精厂得到谷氨酸生产菌T6-13，对以T6-13为宿主菌的五种噬菌体进行纯化并富集，同时进行噬菌斑形态鉴定。采用LB双层琼脂培养基，在含有T6-13宿主菌的上层琼脂层中，五种噬菌体均匀可形成噬菌斑，但其大小，形态，透明度，扩展速度不同。可初步鉴定五种噬菌体的区别。采用PEG（聚乙二醇）沉淀法制备噬菌体，通过蛋白酶K，SDS消化噬菌体蛋白，经酚氯仿抽提，乙醇沉淀得到噬菌体DNA。利用三种限制性内切酶酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明五种噬菌体是不同的。

【关键词】 钝齿棒杆菌;噬菌体DNA;抽提;聚乙二醇;DNA酶切图谱

【中国分类号】 R93【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0495-01

1资料与方法

噬菌体(bacteriophage，phage)是一类感染细菌和放线菌等微生物的病毒，它是由英国细菌学家Twort于1915年首次发现。当时Twort在培养葡萄球菌的过程，发现菌落上出现了透明斑，利用接种针接触此透明斑后再接触另一菌落，结果后者也出现了相同的透明斑。1917年法国的噬菌体Felixd'Herelle发现含有志贺痢疾杆菌的新鲜液体培养物能被某种无菌的污水滤液所溶解，并使混浊的液体培养物澄清，将此种澄清液再过滤加到另一种敏感菌株的新鲜培养液中，获得了相同的结果。他将这种能使菌落形成透明斑以及使混浊液体澄清的溶菌因子叫做噬菌体［1］

发酵生产成败的关键有两个，一是染菌，二是噬菌体。其中噬菌体的危害尤为严重［5］。谷氨酸发酵污染噬菌体是影响味精生产的关键因素之一。生产中如果受到噬菌体的轻度侵染，会使正常生产受到困扰，产酸下降，成本提高．影响企业的效益。若受到严重污染，常常造成"倒罐"，使生产紊乱，甚至被迫停产，工厂将为此付出昂贵的代价。发酵受到噬菌体的污染主要有三大原因，一是环境空气中存在着大量的噬菌体，二是菌种污染了噬菌体，三是发酵过程中被噬菌体所侵染。。多年来，国内味精厂家都非常重视对噬菌体的防治工作，并采取了一系列的防治措施。一是彻底消灭环境中的污染源堪菌体，二是尽可能地杜绝菌种携带噬菌体，三是大力强化空气净化系统。使噬菌体的污染得到基本控制，污染程度逐步减轻［6］。但尚未达到"根治"。若能使谷氨酸生产菌具有噬菌体抗性，才能达到彻底的根治。

由于国内味精行业多采用T6-13为谷氨酸生产菌种，因此对以T6-13为宿主菌的噬菌体的研究显得尤为重要。

2.结果

噬菌体DNA的限制性内切酶分析:噬菌体的种类不同，必然在噬菌体的遗传物质DNA上有所区别。为了进一步鉴定所收集噬菌体的差异，我们将五种噬菌体用三种酶（KpnI,NcoI,HindIII）做酶切，对其酶切图谱进行比较，对五种T6-13噬菌体DNA进行了3种限制性内切酶酶切分析，分别得到3张图谱（五种噬菌体用每种酶分别酶切的图谱），结果发现，五种噬菌体的限制性内切酶图谱显著不同。结合五种噬菌体的噬菌斑大小，透明度，出斑时间的不同，表明它们是五种不同类型的噬菌体。

3.讨论

噬菌体一旦感染宿主菌后会随着宿主的增殖而增殖，而且噬菌体的感染效率非常高，只要重复4次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个细菌细胞致死。噬菌体以自身特定的配体与细菌表面的特定受体结合，引发细菌的感染与噬菌体的增殖。国内味精行业以T6-13为谷氨酸生产菌，经过多年连续使用，噬菌体危害相当严重，对工业生产有极大影响。鉴于噬菌体对其宿主菌的溶解破坏如此特异并且功能强大，因此，对于噬菌体的研究显得十分重要。

本文对五种噬菌体进行3种限制性内切酶的分析，我们在酶切的过程中，按照文献所述方法加反应物，水浴一小时，然后电泳。经紫外照射后，每种噬菌体DNA只有一条带，我们怀疑是酶失活，酶的作用时间不够，或者是这些噬菌体DNA没有这些酶切位点。我们针对每种疑惑分别重复实验。在加反应物时，提高速度，将酶暴露与外界的时间降到最低，电泳结果没有改观；提高酶的作用时间，以十分钟为基准，增加到……时，发现NcoI,HindIII的酶切图谱有条带出现，条带过于粗亮，于是电泳槽内所加DNA稀释……倍，得到了条带清晰分明的DNA酶切图谱。而对于KpnI，我们同过改变实验条件，在……的条件下，只有……号的DNA有条带出现，我们怀疑令四种噬菌体DNA没有 KpnI的酶切位点。由于酶的活性受外界条件影响极大，所以一定要控制好实验速度，尽量快速完成实验，同时掌握好酶的最适温度，最重要的时酶的作用时间，以达到最佳效果。

参考文献

［1］ 徐耀先.分子病毒学［M］,武汉:湖北科学技术出版社，2000.

［2］ BA帕尔涅斯，游凯涛.肿瘤与病毒［M］.北京医科大学联合出版社，1992.

［3］ 王玉池.噬菌体防治浅见［J］，发酵科技通讯，2003，32（1）：17-17.

［4］ 袁品坦.再谈噬菌体的污染及其预防［J］，发酵科技通讯1999,28(4):22-27.

［5］ 葛宗民，丁达明.谷氨酸生产菌噬菌体的限制性内切酶分型［J］，病毒学报，1987，3（1）：76-80.

［6］ 罗勤，汤显春，周履谦.谷氨酸生产菌噬菌体理化特性的初步研究［J］，华中师范大学学报，1997，31（1）：98-99.