难治性癫痫动物模型研究的新进展
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[摘要] 难治性癫痫是最棘手的临床问题之一，其病因至今未明。由于人体脑组织难以获取等限制，难治性癫痫发生机制的研究需依赖动物模型。本文对不同难治性癫痫动物模型的制作方法、表现和机制等方面作综述。
[关键词] 难治性癫痫；动物模型；进展
[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）30-0011-02
Recent progress in the study of animal model of refractory epilepsy
WANG Guangxin
Medical Institute of Paediatrics， Qilu Children’s Hospital of Shandong University， Jinan 250022， China
[Abstract] Refractory epilepsy is one of the most thorny subject and its etiology is unkown. Attempts to study in vivo are harmpered by the lack of suitable brain tissue from patients with refractory epilepsy or controls. Nevertheless， an animal model would be a valuble tool to study mechanisms of refractory epilepsy and to develop more effective treatment approach. This paper reviews establishment， features and mechanism of animal model of refractory epilepsy.
[Key words] Refractory epilepsy； Animal model； Progress
癫痫（epilepsy）是最常见的神经系统疾病之一，由大脑神经元反复发作的异常放电而引起的、以中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病[1]。全球约0.5%～1%的人口受到该病累及[2]，其中70%～80%患者经系统应用抗癫痫药治疗可获得长期缓解，其余20%～30%患者的发作不能得到有效控制，成为难治性癫痫（refractory epilepsy）[1]。难治性癫痫是最棘手的临床问题之一，因为长期反复发作，不仅使患者遭受到躯体痛苦，而且在一定程度上可导致患者心理障碍及引起一系列社会问题[3]，因此，难治性癫痫是目前癫痫研究的难点和重点。由于难治性癫痫患者的脑组织较难获取，即使获取了少量患者的标本，也很难获取正常对照者的脑组织，因此在人体研究难治性癫痫的形成机制难以开展。动物模型可筛选出难治性癫痫和药物有效癫痫，克服了人体研究的缺陷，可用于难治性癫痫发生机制的研究，进而寻找到更加有效的治疗方法[4]。本文对难治性癫痫动物模型研究的新进展综述如下。
1 难治性癫痫动物模型的选择标准及评定
难治性癫痫又称耐药性癫痫，其内涵为发作不能得到有效控制的癫痫。但是，难治性癫痫的定义至今尚未统一，Leppik认为难治性癫痫是指在准确诊断及细致监测下采用抗癫痫药1年后发作仍不能得到完全控制，但多数学者则认为至少2种及以上抗癫痫药连续治疗2年才能判断是否为难治性癫痫[5]。癫痫动物模型的建立将为探讨难治性癫痫的发病机制、筛选鉴定新的抗癫痫药发挥重要作用。难治性癫痫动物模型的选择标准如下：①发作类型及表现与人类难治性癫痫相似；②癫痫发作与自发脑电图活动一致，从而利于评估抗癫痫药对行为和脑电图的影响；③经典抗癫痫药不能有效阻止癫痫发作；④模型动物体内抗癫痫药的浓度在有效范围时，能够长期存活。
难治性癫痫动物模型制作时，动物痫性发作的严重程度按照Racine分级分为五级：Ⅰ级表现为闭眼、胡须动、面部抽搐；Ⅱ级为点头、咀嚼伴面部抽搐；Ⅲ级为一侧前肢抬起、阵挛；Ⅳ级表现站立常伴两侧前肢阵挛；Ⅴ级表现站立、扭转并伴有跌倒[6]。出现Ⅳ级及以上症状时说明癫痫模型建立成功。
2 遗传性癫痫动物模型
有些动物先天具有癫痫的易感性，因此可以成为遗传性癫痫模型。作为狗类最常见的神经系统疾病[7]，狗癫痫发作的类型、脑电图改变与人类癫痫相似，且难治性癫痫狗比药物有效癫痫狗的发作频率更高，病情更严重，因此癫痫狗是一种比较适合的难治性癫痫动物模型。Jambroszyk等以此种模型开展难治性癫痫机制的研究，结果发现难治性癫痫狗大脑毛细血管内皮细胞P-糖蛋白表达上调，与人类难治性癫痫相似[8，9]。癫痫狗也可用于新的抗癫痫药的疗效评估，另外治疗方面，Kluger等认为苯巴比妥合并溴化钾治疗难治性癫痫狗能够取得较好效果[10]，是否可推广用于临床，有待进一步验证。除癫痫狗外，其他遗传性癫痫模型，如声源性敏感致癫痫大、小鼠，光敏致癫痫狒狒，均属反射性癫痫，而非自发癫痫模型，且容易被抗癫痫药控制，不宜作为难治性癫痫动物模型。另外，转入癫痫基因或敲除相关基因也可以制作先天性癫痫动物模型，如与动作电位形成有关的钠离子1.1通道α亚单位基因的突变已用于制作难治性癫痫小鼠[11]。由于转入特定基因或敲除基因所导致细胞、分子异常便于界定，因此可以探讨这些过程在难治性癫痫的形成过程中是否为关键因素。
3 难治性癫痫化学模型
化学性致痫剂如海人酸、匹鲁卡品等可引起动物痫性发作，可制作化学性癫痫模型，常用的有以下几种模型。
3.1 马钱子碱或N-甲基-D，L-天门冬氨酸（NMDLA）/N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）诱发癫痫模型
作用于中枢神经系统兴奋性/抑制性氨基酸的化学致癫剂较多，其中马钱子碱通过阻断甘氨酸受体诱导全面强直发作，NMDLA通过激活谷氨酸受体NMDA亚型而诱导全面强直-阵挛发作，NMDA则直接增强兴奋性氨基酸的功能而诱导癫痫发作。马钱子碱和NMDLA/NMDA诱导的癫痫模型对大部分典型抗癫痫药不敏感，故理论上可作为难治性癫痫动物模型，但是，临床研究发现NMDLA/NMDA拮抗剂不能有效控制此类癫痫发作，对人类难治性癫痫也无效。提示难治性癫痫与兴奋性/抑制性氨基酸的相关性较小，故这种模型不适合用于难治性癫痫发生机制的研究。
3.2 锂-匹鲁卡品模型
匹鲁卡品为胆碱激动剂，可引起部分发作继发全面发作，但是，该模型对传统抗癫痫药如苯巴比妥、安定敏感，给耐药筛选带来了困难。另外，在注射匹鲁卡品前应注意给予甲基莨菪碱（1 mg/kg）注射以缓解匹鲁卡品的外周胆碱能副作用[2]。
3.3 海人酸模型
海人酸是谷氨酸的类似物，其中枢神经兴奋性比谷氨酸强30～100倍[12]。苯二氮■类及三甲双酮对该模型疗效好，但苯妥英、卡马西平及丙戊酸的效果较差，故进行耐药筛选时，需要选择2种抗癫痫药进行筛选。海人酸所致痫性发作的类型为复杂部分性发作，给药方法分为局部用药（如脑室注射）和全身用药（如腹腔注射）。由于Wistar大鼠对海人酸的敏感性高于SD大鼠，故应选用Wistar大鼠建立该模型[13]。
4 难治性癫痫电点燃模型
电刺激动物大脑的许多部位，如杏仁核、海马、前新皮质及隔区等都可引起痫性发作，但杏仁核是最容易引起点燃的部位[13]。杏仁核电点燃模型制作时，首先将大鼠麻醉固定在脑立体定位仪上，确定大鼠杏仁核位置，然后用注射针头穿透骨面，插入直径为0.25 mm的绝缘双极电极，尖端分开约0.25 mm，将电极用牙托粉及502胶水固定在颅骨表面，缝合头皮。术后10 d开始点燃实验[14]。采用电子刺激器输出周期1 s，波宽1 ms，频率50 Hz的恒流电脉冲，生物机能实验记录仪记录大鼠电活动，刺激强度由20 μA开始，每次增加20%，刺激间隔1 min，直至出现3 s或3 s以上的皮层电流即脑电图上出现棘尖或棘慢波，此时电流强度即为后放电阈值（ADT）。ADT确定5 min后给大鼠阈上刺激，双相方波，刺激参数：强度400 μA，波宽1 ms，频率60 Hz，持续时间1 s，刺激间隔时间7 min，直至出现Racine Ⅳ～Ⅴ级行为，即点燃，之后每天如此。点燃动物连续出现10次大发作后24 h测定点燃后ADT。对照大鼠ADT确定后24 h，实验大鼠局部或全身给予抗癫痫药，于最后一次用药后测定ADT，此为用药后ADT值。当与对照ADT比较，给药后ADT增加20%为药物有效癫痫；与对照ADT比较，给药后ADT不增加或增加
5 动物难治性癫痫模型的致痫机制
导致模型动物癫痫发作的机制主要有以下几个方面：①兴奋性升高：神经系统兴奋性神经递质释放增加或功能上调，均可导致大脑兴奋性升高，达到一定阈值后出现癫痫发作，如NMDLA/NMDA癫痫模型。②抑制性减弱：动物脑内抑制性神经递质耗竭或功能减弱，可引起兴奋性阈值下降，引发癫痫发作，如马钱子碱通过阻断抑制性神经递质甘氨酸的受体而诱导全面癫痫发作；反复电刺激可使脑内去甲肾上腺素耗尽，成为杏仁核电点燃的致痫机制之一。③离子平衡失调：与动作电位发生相关的离子浓度失衡后，引起神经元动作电位阈值下降，出现神经元异常放电。④回返性兴奋性环路形成：苔藓纤维发芽是癫痫动物海马的病理改变之一，其芽生侧枝会回返进入大脑皮质颗粒层支配颗粒细胞，形成回返性兴奋性环路，使痫性放电和痫逐渐强化，最后出现癫痫大发作。如急性杏仁核点燃模型动物大脑已证实有苔藓纤维发芽[16]，可能是该类模型的致痫机制之一。
总之，目前大多数研究构建的难治性癫痫动物模型与人类癫痫的症状、脑电图改变相似，为难治性癫痫发生机制研究及新的抗癫痫药评价和筛选提供了必要的工具。这些模型中以杏仁核电点燃模型和海人酸模型应用最为广泛，其中前者具有较好的稳定性，易于量化，但该模型制作技术要求较高，制作过程繁琐。而海人酸模型制作简单，但对苯巴比妥、安定治疗的反应较好，为难治性癫痫的筛查带来一定限制。
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（收稿日期：2012-09-18）