超高效液相色谱电喷雾离子化四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素

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1 引 言

毒蘑菇又称毒蕈，是指含有不同类型毒素的大型真菌。由于有些毒菌和食用菌的宏观特征没有明显区别，且至今还没有找到快速可靠的毒蘑菇形态鉴别方法，因而人们误食毒蘑菇而引发中毒的事件时有发生。据统计，在欧美、日本等国普遍发生的蘑菇中毒事件中，95%是由鹅膏菌属引起的。广东是国内发生毒蘑菇中毒事件较多的省份之一，初步统计，广东毒蘑菇有112 种，引起中毒的同样是鹅膏菌属（Amanita），有20 种，其中主要有灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种等＼[1＼]。鹅膏菌中引起中毒的毒素主要是鹅膏肽类毒素，可分为鹅膏毒肽（Amatoxins）、鬼笔毒肽（Phallotoxins）和毒伞肽（Virotoxins）三类。鹅膏毒蕈中的这三类毒素均属环肽类中分子物质，参与毒素组成的氨基酸大多是非蛋白质氨基酸。鹅膏毒肽是一种双环八肽，已分离纯化的有9种＼[2＼]，其中α鹅膏毒肽（αAmanitin）和β鹅膏毒肽（βAmanitin）在鹅膏蕈中含量最高，且毒性最强，是鹅膏蕈中毒的主要原因。鬼笔毒肽是一种双环七肽，已分离鉴定出的鬼笔毒肽类毒素有7种＼[2＼]，主要有二羟鬼笔毒肽（phalloidin）和羧基二羟鬼笔毒肽（phallacidin）。毒素分子结构见图1。鹅膏肽类毒素化学性质稳定，耐高温、耐干燥和酸碱，一般的烹调加工不会破坏其毒性，该类毒素易溶于甲醇、乙醇、液态氨、吡啶和水。

目前，文献报道的毒蕈毒素的质谱联用方法主要有液相色谱飞行时间质谱法对3种毒蕈毒素的测定＼[3＼]，毛细管电泳四级杆串联质谱法分析5种毒蕈毒素含量＼[4＼]，液相色谱多级线性离子肼质谱法测定1种毒蕈毒素＼[5＼]，超高效液相色谱四级杆串联质谱法快速检测3种毒蕈毒素含量＼[6＼]，超高效液相色谱四级杆串联质谱法测定5种毒蕈毒素含量＼[7＼]，以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术 （MALDITOF）对3种毒蕈毒素进行鉴定＼[8＼]。这些报道主要侧重于毒素定量测定方法的研究，分析数据以普通分辨率和一般质量精度的四级杆质谱或离子肼质谱技术为主，或是单级飞行时间质谱（TOF）数据，在应用高分辨串联质谱技术进行定性鉴定分析方面还鲜见报道，也未见有系统的关于质谱指纹图谱应用于毒蕈毒素鉴定方面的文献。超高效液相色谱电喷雾离子化四级杆飞行时间串联质谱技术（UPLCESIQTOF）可以精确测定鹅膏肽类毒素分子离子及其同位素的质量数和丰度比例，结合二级质谱的分子结构碰撞裂解特征分析，在对未知化合物的分析鉴定方面比一般液相色谱串联质谱技术要更为精准和可靠。色谱和质谱指纹图谱能够反映化合物的特性，在突发事件中毒检测鉴定中具有极重要的作用。

本研究采用UPLCESIQTOF技术，建立了蘑菇菌样品中α鹅膏毒肽、β鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽4种毒素特征信息的高分辨质谱指纹图谱和分析鉴定方法，方法快速、准确、选择性好、特异性强，为毒素的定性确证提供了一种可靠方法，适用于突发毒蕈中毒事件的毒素确证分析。2 实验部分