阿司匹林合用琥乙红霉素对大鼠肝细胞色素P450同工酶和mdr1的影响
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摘要：目的以大鼠作为实验动物，形成疾病模型，研究阿司匹林合用琥乙红霉素对大鼠肝脏细胞色素p450同工酶和多药耐药基因的影响。方法用分光光度法测定大鼠肝微粒体红霉素N-脱甲基酶（ERD）、氨基比林N-脱甲基酶（ADM）的活性，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定大鼠肝脏CYP3A1、CYP1A2、CYP2E1、mdr la和mdr lb基因的水平。结果大鼠连续灌胃给药7 d后，与空白组大鼠比较，琥乙红霉素组ERD和ADM活性均明显受抑制（P＜0.05)，阿司匹林组ERD和ADM活性均不同程度提高，琥乙红霉素与阿司匹林合用组对ERD、ADM活性均表现抑制作用，且对大鼠肝脏CYP3A1、CYP2E1、mdr la、mdr lb基因表达量减少。各组的CYP1A2基因未能检出。结论琥乙红霉素抑制ERD、ADM活性及CYP3A1基因的表达，阿司匹林可对抗琥乙红霉素对肝药酶的抑制作用，两者存在基于肝药酶的相互作用，合用的结果可能导致琥乙红霉素对肝药酶抑制作用减弱。
关键词：琥乙红霉素；阿司匹林；细胞色素P450；多药耐药基因；药物相互作用
中图分类号：R969.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)07-0008-05
Effects of Coadministration of Aspirin with Erythromycin Ethylsuccinate on Liver Microsomal Cytochrome P450 Isoenzyme and mdr l in Rats
ZOU Wen1, ZHOU Wen2*, OU Yang2
(1.School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Department of Pharmacy, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)
Abstract：Objective To study the effects of coadministration of aspirin with erythromycin ethylsuccinate on liver microsomal cytochrome P450 isoenzyme and multidrug resistance gene (mdrl) in rats. Methods The activities of liver microsomal erythromycin N-demethylase (ERD)and aminopyrine N-demethylase (ADM) were measured by spectrophotometry. The levels of mRNA expressions of CYP3A1, CYP1A2, CYP2E1, mdrla and mdrlb in hepatic microsome were determined with RT-PCR method. Results After administration for 7 days, the activities of ERD and ADM were markedly inhibited by erythromycin ethylsuccinate(P＜0.05), while the activities were enhanced in different extent by aspirin; the activities of ERD and ADM, mRNA expressions of CYP3A1, CYP2E1, mdrla and mdrlb were all inhibited by the coadministration of erythromycin ethylsuccinate and aspirin. The CYP1A2 gene was not detected in all groups. Conclusion Erythromycin ethylsuccinate can inhibit the activities of ERD and ADM and decrease the expression of CYP3A, while aspirin has an opposite effect against erythromycin ethylsuccinate. The coadministration of aspirin with erythromycin ethylsuccinate may reduce the inhibitory effect of erythromycin ethylsuccinate on liver CYP450.
Key words：erythromycin ethylsuccinate; aspirin; CYP450; multidrug resistance gene; drug interactions
阿司匹林为非选择性环加氧酶抑制剂。药理实验及临床实践表明，小剂量（50～150 mg/d）阿司匹林可抑制血小板中环加氧酶1（COX-1），减少血栓素 A2（TXA2）生成，从而预防心脑血管病的发病和短暂性缺血发作。因此，临床上将阿司匹林用于预防治疗脑血栓、冠心病、心肌梗死、心绞痛等。因阿司匹林在临床广泛且频繁使用，因此也有与其他药物，如激素、降血糖药、抗生素等合用产生相互作用的问题，如与氨基糖苷类、磺胺类抗生素合用，可增加后者的血药浓度和不良反应的发生率。调查了我院2007年4~6月6 000份用药处方发现，阿司匹林与琥乙红霉素联合应用的比例高达18 %，而两者合用的情况鲜有报道[1-4]。我们通过研究阿司匹林合用琥乙红霉素对大鼠肝脏细胞色素P450（cytochrome P450，P450）和多药耐药基因mdr la、mdr lb表达的影响，阐明两者可能存在的相互作用机制，为临床用药提供理论参考。
1材料与方法
1.1药品与试剂
琥乙红霉素片（西安利君制药公司，批号H61022359，规格0.125 g）；阿司匹林胶囊（青岛黄海制药公司，批号H37023121，规格25 mg）；酮康唑片（西安杨森制药公司，批号H10930212，规格200 mg）；红霉素（erythromycin，分析纯，纯度＞98 %，批号070702），NADPH生成系统（4 mmol/L NADP，10 mmol/L G-6-P，4 U/mL G-6-PD，均为上海蓝季科技发展有限公司）；琼脂糖（Sigma公司，分析纯试剂）；Nash试剂（新鲜配制）；UNIQ-10柱式Trizol总 RNA 抽提试剂盒，PCR Macker，MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒，GeneRuler 50bp DNA Ladder（上海生工生物工程技术服务公司）。
1.2RT-PCR引物
由上海生工生物工程技术服务公司合成，见表1。
1.3实验动物
健康雄性Wister大鼠30只（体重200～220 g，清洁级，编号：SCXK鲁20030004，山东大学实验动物中心提供）。常规条件饲养，自由进食饮水。动物房定时通风消毒，保持室温23～25 ℃，湿度30 %～70 %。
1.4主要仪器
UV-3000紫外分光光度计（日本岛津公司）；JP-300WP电子天平（日本KYOTO）；64R低温高速离心机（日本HITACHI公司）；手动组织匀浆器（上海生工生物有限公司）；LX-100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；PTC-200PCR扩增仪（美国MT Research公司）；DYY-8C电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；GIS2010凝胶图像处理设备（上海天能科技有限公司）；ZHJH-1209超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司）；AlphaEaseFC 4.0图象分析仪（美国Alpha Innotech公司）
1.5动物分组及给药
琥乙红霉素和阿司匹林分别用5 ‰CMC-Na溶液配成悬浊液。大鼠给药剂量按体表面积折算，随机分为空白对照组（5 ‰ CMC-Na 2mL）、酮康唑阳性对照组（150 mg/kg）、琥乙红霉素组（168 mg/kg）、阿司匹林组（5.25 mg/kg）及琥乙红霉素（168 mg/kg）＋阿司匹林（5.25 mg/kg）合用组，每组6只，每天灌胃给药1次，连续给药7d，禁食12 h后断头处死，取肝脏制备微粒体及RNA。
1.6实验方法
1.6.1肝微粒体的制备大鼠末次给药后禁食不禁水1夜，次日断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，用注射器从肝门静脉注入经冰浴的生理盐水溶液冲洗肝脏至浅土黄色，取出肝脏。用钙沉淀法[5]制备肝微粒体：用0.25 mol/L蔗糖溶液洗净表面血污，用滤纸吸干水分，称重。将肝脏剪碎，按每克肝脏加3 mL缓冲液的比例加入蔗糖溶液，冰浴中用组织匀浆机制成20 %（W/V）的组织匀浆。依次离心：离心（9 000×g，4 ℃）15 min，取上清置离心管，离心（19 000×g，4℃）20 min，取上清，每毫升加入88 mmol/LCaCl2溶液0.1 mL，使CaCl2终浓度为8 mmol/L，冰浴搅拌5 min后，离心（27 000×g，4℃）15 min，弃上清，所得粉红色沉淀即为肝微粒体，再用pH 7.4 的0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液5 mL重新悬浮。分装于冻存管中，液氮速冻后，置－80 ℃冰箱备用。全过程在0～4 ℃低温下进行。微粒体蛋白质含量用考马斯亮蓝法定量。
1.6.2药物代谢酶测定分别取0.1 mmol/L甲醛工作液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL加至试管中，各试管用超纯水补至2.0 mL，加入Nash试剂2.0 mL，60 ℃水浴10 min，自来水冷却，于420 nm处测定各管的吸光度。以A420值为纵坐标，甲醛浓度为横坐标，绘制甲醛标准曲线。
用分光光度法测定红霉素N-脱甲基酶（erythromycin N-demethylase, ERD）和氨基比林N-脱甲基酶（aminopyrene N-demethylase，ADM）的活性 [6]。红霉素和氨基比林的终浓度分别为0.4 mmol/L和8 mmol/L，以NADPH 发生系统启动反应，37 ℃反应10 min，以15 % ZnSO4及饱和Ba(OH)2终止反应，离心，取上清以Nash 试剂作显色反应，测定420 nm处吸光度A420，根据甲醛标准曲线计算ERD、ADM活性，用每分钟每毫克蛋白中的甲醛量（μmol）表示。蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。
1.6.3肝组织总RNA提取及CYP450、mdr l基因的RT-PCR分析[7,8]大鼠末次给药后禁食不禁水1夜，次日断头处死，迅速取出肝脏，用UNIQ-10柱式Trizol总 RNA 抽提试剂盒提取肝脏总RNA。电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，A260/A280比值为1.7~1.9，总RN断完整未降解可用。按MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒说明书进行逆转录和PCR扩增反应。反转录条件：40 ℃，30 min进行cDNA合成；94 ℃，预变性2 min；扩增条件：94 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，1 min，扩增40个循环。最后72 ℃，延伸10 min，得扩增产物。将RT-PCR扩增产物等体积上样，做琼脂糖（1.5 %）凝胶电泳。用凝胶图像处理系统（GIS2010型）拍照，检测时以CYC基因的RT-PCR产物为内参照，计算各同工酶基因和CYC基因扩增条带表达量象素灰度的比值，作为P450同工酶mRNA表达的相对水平。
1.7统计学处理
数据以x―±s表示，组间差异用t检验和方差分析。
2结果
2.1琥乙红霉素合用阿司匹林对大鼠肝脏ERD和ADM酶活性的影响
甲醛在0.05～0.5 mmol/L浓度范围内与A值有良好的线性关系，最低检测限为0.05 mmol/L。以A值为纵坐标，甲醛浓度为横坐标绘制甲醛标准曲线，线性方程y=2.085 9x+0.003 6，相关系数r为0.999 2。见表2与图1。
由表2和图1可见，大鼠给药7 d后，与空白组相比，酮康唑阳性对照组大鼠肝微粒体的ERD酶活性显著降低（P＜0.05），但ADM酶活性未受明显影响（P＞0.05）；琥乙红霉素组大鼠肝微粒体的ERD和ADM酶活性均有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；阿司匹林组ERD酶活性则明显增强（P＜0.05），ADM酶活性虽略有增加，但无统计学意义（P＞0.05）；合用组ERD、ADM酶活性均受抑制（P均＜0.05），但抑制作用较琥乙红霉素弱（P＜0.05）。
表2阿司匹林和琥乙红霉素对大鼠肝脏ERD和ADM酶活性的影响（x―±s，n=6）
注1. 空：空白组；酮：酮康唑阳性对照组；琥：琥乙红霉素组；阿：阿司匹林组；合：合用组（下同）。注2. 抑制率1对应ERD酶活性，抑制率2对应ADM酶活性
2.2CYP3A1、2E1、1A2基因的RT-PCR分析
给药7 d后，酮康唑阳性对照组和琥乙红霉素组大鼠肝脏CYP3A1/CYC和CYP2E1/CYC比值均降低（P＜0.05）；阿司匹林组CYP3A1/CYC比值明显增高（P＜0.05），CYP2E1/CYC比值略有增加但差异无统计学意义。合用组CYP3A1/CYC和CYP2E1/CYC比值均有降低（P＜0.05），但同琥乙红霉素组比较无统计学差异。见表2及图1、2。各组大鼠的CYP1A2基因均未检出，但内参CYC基因均可见表达。
表3阿司匹林和琥乙红霉素对大鼠肝脏CYP3A1和CYP2E1基因表达的影响（x―±s，n=6）
2.3mdr la、mdr lb基因的RT-PCR分析
给药7 d后，与空白组比较，酮康唑组可使大鼠肝脏mdr la/CYC和mdr lb/CYC比值明显降低（P＜0.05）；阿司匹林组的mdr la/CYC和mdr lb/CYC比值无明显变化；琥乙红霉素组和合用组的mdr la/CYC和mdr lb/CYC比值均明显降低（P＜0.05）。见表4及图3。
3讨论
临床使用的阿司匹林多为肠溶片剂，可以延缓水解速度，保留药效。琥乙红霉素为酯化红霉素，对酸稳定，且有价格便宜，肝毒性小等优点。长期使用阿司匹林作为预防用药的患者，在感染军团菌或支原体肺炎及流感杆菌引起上呼吸道感染时以琥乙红霉素为首选药物。
P450是人体药物代谢的主要酶类，可以代谢多种内源性和外源性化合物，从而影响药物的药动学、疗效及安全性。药物间相互作用的最重要机制是药物对P450酶系的影响，鉴于人体内试验受很多条件的限制，目前研究常用大鼠肝微粒体做药物体外试验。
CYP3A作为参与口服药物首过效应的主要酶系，是造成药物间相互作用的重要原因之一。红霉素N-脱甲基酶是一种P450同工酶，通过测定肝微粒体中CYP3A催化生成甲醛的速率，可以获悉肝微粒体中CYP3A酶的活性大小。琥乙红霉素的水解产物红霉素是CYP3A的典型底物，本研究结果表明，阿司匹林可明显增强ERD活性，琥乙红霉素则起抑制作用，与文献报道相符。两者合用抑制ERD活性的作用比单用琥乙红霉素弱。在大鼠肝脏和小肠中CYP3A亚族的最主要亚型为CYP3A1和CYP3A2。RT-PCR结果显示，与酮康唑组和琥乙红霉素组相比，阿司匹林与琥乙红霉素合用抑制CYP3A1的作用减弱。上述实验结果提示：琥乙红霉素作为CYP3A抑制剂，与具有促CYP3A活性作用的阿司匹林合用，抑制CYP3A1的作用减弱，因此，可能减慢琥乙红霉素在肝脏的代谢速率，增加其血药浓度。
氨基比林N-脱甲基酶主要反映CYP1A2、2E1、2C11的活性，人和动物的CYP2E1活性十分近似，迄今发现所有CYP2E1的底物在人和动物中都是相同的[9]。本实验显示，琥乙红霉素对ADM活性有明显抑制作用，阿司匹林则对该酶仅有微弱的诱导作用，两者合用对酶的抑制作用比已知的抑制剂酮康唑更强，表明琥乙红霉素对肝药酶的影响强于阿司匹林。文献报道[10-12]阿司匹林可能通过增加微粒体的p-硝基酚羟基化作用，导致CYP2E1核糖核酸信使表达提高，从而增加CYP2E1活性。因为阿司匹林的水解产物水杨酸是CYP2E1的底物，在5'位会发生5-羟基化作用，生成2,5-二羟苯甲酸诱导CYP2E1；并且阿司匹林可通过增加CYP2E1酶稳定性来增加活性。但本研究中阿司匹林仅微弱诱导CYP2E1，考虑可能是因阿司匹林的剂量小，而且实验动物之间有种属差异，所以诱导作用不足以抵消琥乙红霉素的抑制作用，因此，可忽略阿司匹林对CYP2E1的影响。各组RT-PCR分析未能检出CYP1A2基因表达。生理条件下CYP1A2在肝脏中含量极低，主要存在于肝外组织例如肺脏，只有被诱导活化，肝中含量才会迅速增加。实验中琥乙红霉素为酶抑制剂，阿司匹林为微弱的酶诱导剂，合用的结果是酶活性被抑制，因此，各组CYP1A2基因难以检出。
人MDR基因的产物是P-糖蛋白（P-glycoprotein），它过量表达与肿瘤细胞的多药耐药有关。P-糖蛋白同时存在于CYP3A大量表达的细胞内如肠细胞和肝细胞，它可减少药物在肠道的吸收，也可通过肝细胞膜增加药物的消除。CYP3A的底物或调控剂与P-糖蛋白底物或调控剂常是共享的，影响CYP3A的因素也能影响P-糖蛋白的表达，但P-糖蛋白在药物代谢与相互作用中的研究尚少。与人类不同，大鼠具有两个编码P-糖蛋白基因，分别是mdr la、mdr lb，具有与人mdr1类似的功能[13]。由于扩增的mdr lb基因和CYC基因大小十分接近，故分别扩增。本研究表明，琥乙红霉素对大鼠mdr la和mdr lb基因有明显的抑制作用，它与阿司匹林合用较琥乙红霉素单用对mdr la和mdr lb基因的表达有更强的抑制作用。上述结果提示：琥乙红霉素和阿司匹林合用可明显抑制大鼠肝mdr la和mdr lb基因的表达，从而可能减少琥乙红霉素在肝脏的代谢及消除。
阿司匹林和琥乙红霉素作为临床常用药，应用广泛，因此阐明两者可能存在的相互作用机制对临床用药具有指导意义。此外，国外有关研究越来越关注肠道细胞对药物的代谢、排泄作用。肠道细胞的代谢酶CYP3A和外向转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)组成药物肠道吸收的主要屏障[13]，阿司匹林和琥乙红霉素合用是否也会抑制小肠的CYP3A及P-糖蛋白。因此，有关阿司匹林与琥乙红霉素合用血药浓度的变化，及其可能存在的相互机制有待进一步研究
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注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”