甲状腺相关性眼病动物模型的研究进展
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摘要：甲状腺相关眼病（ thyroid- associated ophthalmopathy， TAO）是一种器官特异性自身免疫性疾病，为细胞免疫和体液免疫在遗传因素、环境因素条件下共同作用的结果，居成人眼眶病中发病率之首。建立一种理想的动物模型将为研究 T AO的发病机制和治疗手段提供良好的平台。已有学者采用人促甲状腺激素受体活化的脾细胞免疫同源 BALB/c小鼠建立TAO动物模型。到目前为止，各种动物模型有其各自的优势和劣势，从不同模型中获得的信息远大于单一模型。
甲状腺相关性眼病是一种与甲状腺疾病相关的器官特异性自身免疫性疾病[1]。在环境与遗传因素的相互作用下， 机体免疫系统产生了针对促甲状腺激素受体（ Thyrotropin receptor， THSR ）的抗体（TRAb）。其中，刺激性抗体（TSAb）可模拟TSH 功能，导致甲状腺激素过度分泌。其发病机制尚未阐明，治疗也比较棘手。TAO是一种自身免疫性疾病，而自身免疫性疾病的基本特征之一就是用致敏的淋巴细胞可使疾病被动转移，并能在动物身上复制出与人类自身免疫性疾病相似的动物模型[2]。理想动物模型的建立向来是深入研究疾病的发病机制，探索有效治疗措施的途径之一。本文对 TAO动物模型相关的文献进行综述。
1 理想的TAO动物模型的特点
TAO 各方面表现可通过不同方式诱导。对于一个理想的 TAO模型，应具备如下几个或所有特征：①血清中总甲状腺激素水平升高或促甲状腺激素水平降低；②存在有活性的促甲状腺素受体抗体，至少有促甲状腺激素结合抑制性免疫球蛋白，即甲状腺刺激性抗体；③甲状腺有相应的病理改变；④具有甲亢的临床特征，如体重降低；⑤类似于TAO 的眼部改变，如眼外肌结构的破坏、水肿、淋巴细胞浸润和眶脂肪堆积。
眼眶组织的病理检查发现：水肿、淋巴细胞浸润和黏多糖改变主要发生在眶脂肪和泪腺组织。这种致突眼方法可能是使大量甲状腺抗原，包括TSHR释放入循环，打破免疫耐受，启动眼眶自身免疫反应，导致淋巴细胞浸润和眼眶水肿[3]。此外，高水平的循环TSH，包括内源性的和垂体提取物，都能刺激脂肪形成，导致随后的眶脂肪堆积。
2 建立TAO动物模型的方法学进展
2.1单纯TSHR免疫 采用人工合成 TSHR多肽诱导，或用细菌产生重组 TSHR的融合蛋白，即将 TSHR的胞外区（ECD）与麦芽糖结合蛋白（MBP）联结成为ECD-MBP融合蛋白后免疫动物；利用杆状病毒群将TSHR胞外部分的基因转入昆虫细胞，纯化后获得TSHR-ECD多肽，来免疫动物。
2.2 TSHR核酸免疫 核酸免疫是使真核细胞表达载体克隆出人类 TSHR的全长cDNA ，并将其注入小鼠胫骨前肌中获得免疫。注射部位的肌肉细胞摄取cDNA后将蛋白产物表达于细胞表面。用含TSH受体cDNA的PBS和25%蔗糖制剂处理 NMR I杂合小鼠后小鼠的血清中均出现TRAb，其中部分雄鼠（9/30）表现为甲状腺功能减退，部分（4/30）表现为甲亢，同时出现了类似人类TAO的眼部表现[4]。
2.3表达 TSHR的细胞免疫 利用表达人类 TSH受体和鼠 MHCⅡ类抗原分子的纤维母细胞免疫 AKR /N小鼠。经过 11～12w后，多数小鼠自发性死亡并伴有甲状腺肿大。30%～40%实验组小鼠的血清甲状腺激素水平明显高于对照组，并且在血清中发现具有刺激甲状腺活性的TRAb。或用ECD-MBP或核酸免疫活化T细胞，再将活化的T细胞移植给同源BALB/c和NOD小鼠，16d后均出现类似于ECD-MBP免疫小鼠的甲状腺炎，多数 BALB/c小鼠出现类似于TAO的眼眶组织病理学改变[5]。
2.4 TSAb转基因 TSAb模拟TSH的功能可持续刺激甲状腺，是导致甲状腺激素过度分泌并出现甲亢临床症状的关键。有学者发现，来自TAO患者的TSAb经过B细胞克隆后，同样能结合 TSHR 并刺激甲状腺，引起高功能表现。于是，他们把人的 TSAb基因转入小鼠的受精卵中，培育出TSAb 转基因小鼠。结果68 %的TSAb 转基因小鼠出现T4升高伴TSH降低，20%T4升高伴TSH正常，T4和TSA b-IgM存在正相关关系[6]。组织学检查发现有高功能分泌的表现，同时还发现TSA b-IgM-B 细胞的数量比预计的要低，提示B 细胞可能自我激活，发生了克隆剔除，这是免疫耐受的关键。
3 TAO动物模型的研究进展
多年来，研究者们尝试建立TAO的动物模型，模拟出TAO的特征如体重减轻、甲状腺肿等，更重要的是造成其眼球突出。人们认为采用接受"长效甲状腺刺激物"如甲状腺刺激抗体（ TSAB）的方法建立的动物模型不被认可。随着对TAO的自身免疫性机制的逐渐认识，利用甲状腺轴建立合适的 TAO动物模型的方案被认为是不可行的。
令人信服的TAO动物模型需要应用TSHR的克隆技术以及大量用于免疫反应的受体[6]研究者尝试了很多诱导TAO的动物模型，包括用表达TSHR的B细胞或人类胚胎细胞293接种BALB/c鼠；用TSHR-cDNA的质粒作为载体接种杂交鼠；用腺病毒作为载体先接种树突状细胞，再接种到BALB/c鼠等。以上尝试的共同点是均用表达TSHR的活体载体接种动物，以激发动物的免疫系统；另一个共同点是均需多次接种才能产生有活性的抗体。最近，研究者用B6B7抗体的可变区结合人类IgM的恒定区培养了TSAb2转基因鼠TAO动物模型，其甲亢发病率达68%，并具有血T4和TSA b升高、TSH降低、甲状腺肿大等特征。
目前的各种动物模型有着各自的优势和劣势。Shimojo模型具备很多GD的特征，但是这种模型仅局限于AKR/ N鼠种，并且其高甲状腺素血症和TSA b活性仅维持3个月，相对较短。用TSHR-c DNA的质粒可以接种不同种类的实验鼠，并且其脾细胞可用于记忆T细胞应答性的体外研究，但是这种模型的重复性差，而且至少在BALB/c鼠种中，其甲亢发生率相对较低。腺病毒接种的实验鼠具有和质粒实验鼠相似的优势，并且在不同试验室间的可重复性较好，在BALB/c鼠种中甲亢发生率达50%，但是在C57BL/6鼠中仅25%发生甲亢，而在DBA/1J、DBA/2J、CBA/J和SJL/J鼠种中均未发生甲亢。
关于建立TAO动物模型的方法，Ludgate [7]认为以下方法值得推荐：①利用转染了同源的 MHCⅡ类分子的细胞和人类或鼠类全长的 TSHR免疫AKR/N小鼠；②将TSHR活化的T细胞传递给同源的BALB/c小鼠；③用人类全长TSHR的核酸免疫NMR I杂合小鼠。
4 小结
综上所述，目前在建立TAO动物模型的探索中已取得了一定的进展，但离建立完美的TAO动物模型仍有较大的距离。随着对TAO发病的免疫学机制的认识，利用TSHR或其基因以及其他相关抗原来免疫动物的方法被多数学者接受。TSAb转基因动物模型发育过程中伴随了自身免疫的某些机制，如克隆剔除、对抗原的无反应以及对自身抗原耐受的突破，并且转基因模型可进行传代，避免了研究过程中需反复构建模型的麻烦，是一个全新的方向。TAO动物模型主要为鼠类，尚无精确评估测量活体鼠类动物模型的技术，另外鼠类体型小，缺乏硬性的眶缘，无法测量眼球突出度。Laitt等报道了吸入麻醉下抑脂 MRI 技术，可以很清楚地显示眼外肌和眶脂肪，动态随访模型动物的眼病变化。建立可供研究与治TAO的合适的动物模型还有待于多方面的探索。
参考文献：
[1]Barrett K， Liakata E， Rao PV， et al. Induction of hyperthyroidism in mice by intradermal immunization with DNA encoding the thyrotropin receptor.Clin Exp Immunol，2004，136：413-422.
[2]Tina M， Jacqueline AG， Prakash VR， et al Dynamics of thyroid-stimulating and blocking Antibodies to the thyrotrop in receptor in amurine Model of Graves'disease.Endocrinology，2004；145：1539.
[3]Cmelo J， Chynoransky M， Podoba J， et al. Epidemiology of the endocrine orbitopathy.Cesk Slov Oftalmol 2006；62（6）：373-380.
[4]Prummel MF， Bakker A， Wiersinga WM， et al. Multicenter study on the characteristics and treatment strategies of patients with Graves orbitopathy：the first European Group on Graves Orbitopathy experience.Eur J Endocrinol 2003；148：491-495.
[5]Schotthoefer EO， Wallace DK. Strabismus associated with thyroid eye disease.Curr Opin Ophthalmol 2007；18（5）：361-365.
[6]Bahn RS. Pathophysiology of Graves ophthalmopathy：the cycle of disease.J Clin Endocrinol Metab 2003；88（5）：1939-1946.
[7]Heufelder AE. Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease.Rev Endocr Metab Disord 2000；1（12）：87-95.编辑/哈涛