高效液相色谱法检测蛹虫草胶囊中腺苷含量的方法研究

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摘要 建立了蛹虫草胶囊中腺苷含量检测的色谱优化方法。在260 nm的检测波长下，采用外标法对腺苷含量进行定量分析，在0.4～60 μg/mL线性范围内拟合线性回归方程：y=25.496 x+1.025，相关系数为0.999 7。方法的检测限为0.06 μg/mL，定量限为0.14 μg/mL。加标回收试验显示，回收率在96.9%～104.1%之间，RSD为3.43%。方法的精密度为1.02%。对试验结果进行统计分析，结果表明，260nm的检测波长能显著提高样品中腺苷含量测定值，结果更为准确、可靠。

关键词 高效液相色谱；蛹虫草胶囊；腺苷

中图分类号 O657.7+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0324-02

腺苷作为蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]中的主要功能成分，是一种生物来源的钙离子抗结剂和心肌收缩因子，具有调节中枢神经系统和抑制血小板聚集的功能。此外，腺苷对辐射造成的伤害也有一定的保护效果[1-2]。正因为腺苷有着极其重要的药用价值，《中华人民共和国药典》将腺苷作为了虫草的一种特征指标并规定其含量不得低于0.01%。而实际上，不同级别的蛹虫草中腺苷含量有显著性差异[3]，蛹虫草和野生冬虫夏草中的腺苷含量也不尽相同[4]。目前，随着保健品市场需求量的急剧扩增及虫草资源的逐渐枯竭，虫草的质量问题已日益显现并日趋严重。因此，对蛹虫草中腺苷的含量进行检测，明确蛹虫草的质量，对规范中草药市场及巩固中药材生产的地位具有十分重要的作用。该文在保健食品评价技术规范[5]的基础上，对蛹虫草胶囊的前处理方法及样品检测的色谱优化方法进行了研究，使之更适合腺苷含量的定量分析，实现了高效准确的检测要求。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

腺苷标准品，纯度99.0%±0.5%，sigma试剂公司生产；磷酸二氢钾（分析纯），由国药集团化学试剂有限公司生产；甲醛（色谱纯），由德国Merck公司提供；水相针式滤器（13 mm×0.45 μm），由上海安谱科学仪器有限公司生产。

1.2 试验仪器

Agilent1200高效液相色谱仪：配有在线脱气机，四元泵，柱温箱，自动进样器，DAD检测器，美国安捷伦公司；Millipore Milli-Q Academic纯水机，美国密理博（上海）贸易有限公司；电子天平：ALC-210.4型，德国ACCULAB；SIGMA离心机，3k15型，德国；超声波清洗器，KQ-250E，昆山市超声仪器有限公司；HTY-HOMO761匀浆机，杭州泰林生物技术设备有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（5 μm，4.6×150 mm）；流动相：甲醇：磷酸二氢钾（0.01 mol/L）=10∶90；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；进样体积：10 μL；柱温：20.0 ℃。

1.3.2 腺苷标准溶液的制备[5]。准确称取腺苷标准品0.020 0 g，加超纯水溶解并定容至50 mL，此溶液每1 mL含0.4 mg腺苷。分别从中吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 mL于100 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，即得0.4～60.0 μg/mL系列标准溶液。

1.3.3 样品溶液的制备。称取约0.25 g的已预先粉碎的样品于25 mL容量瓶中，加入20 mL纯水，超声提取30 min，定容至刻度，振摇混匀，于3 000 r/min离心5 min，经0.45 μm滤膜过滤后待测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

样品应少量称取，样品量过大在加水定容后不易混匀。如果样品一次称量过多，需放置冰箱中过夜，让样品缓慢分散均匀。超声波处理有利于样品中腺苷的提取，且随着提取时间的延长，提取率会显著增加然后逐渐趋缓[6]，考虑到太长的处理时间会影响试验进度，选择超声波处理时间为30 min。

2.2 色谱分析条件的优化

参照《保健食品检验与评价技术规范 保健食品中腺苷的测定》[5]，改变流动相组成、流速和检测波长，比较不同检测条件下的腺苷检测结果，同时进行统计分析，结果见表1。显然，无论是改变流动相中的有机相组分的比例还是改变检测波长，腺苷的检测结果均显著高于规范中方法的分析结果，特别是提高有机相的比例后，腺苷的检测值最高。在260 nm和250 nm处的腺苷检测结果彼此之间差异并不显著，无论是增加流速还是减少流速，得到的腺苷检测值均显著低于原分析方法的检测值，特别是减少流速后，腺苷的检测值降为最低。

考虑到增加及减少流动相中甲醇的比例，色谱峰峰型会发生显著变化，且影响色谱峰分离度。因此，保留规范中的流动相比例不变。改变流速后的腺苷检测结果要显著低于规范的检测结果，因而也保留规范中的流速不变。260 nm是腺苷的最大吸收波长，且相对原检测方法，此波长下的检测值显著增加。因此，选择260 nm的检测波长作为优化的色谱分析条件。

2.3 样品中腺苷的检测

蛹虫草胶囊样品及腺苷标准品溶液的色谱图见图1、2。由图可知，腺苷标准品的保留时间为11.182 min，与夏敏等[7-8]的液谱分析结果相似，通过将样品中腺苷的保留时间与标准品的进行对比，可实现腺苷的定性分析。样品中腺苷的保留时间与标准品相近，此外，样品腺苷的紫外光谱图与标准品的完全重合，因而可断定分析物为腺苷。在当前的色谱分析条件下，腺苷的分离度均在4.5以上，未受杂质峰的影响，运行情况良好。

2.4 线性范围

对浓度为0.4～60.0 μg/mL的腺苷标准溶液进行检测，以浓度为自变量，以峰面积为应变量，拟合线性回归方程：y=25.496 x+1.025，线性相关系数为0.999 7。

2.5 方法的检测限、定量限和回收率

将标准溶液进行逐渐稀释，当其产生的信号值分别为基线噪音6次重复性标准偏差的3倍和10倍时即为检测限和定量限。方法的检测限为0.06 μg/mL，定量限为0.14 μg/mL。

往空白样品中添加腺苷标准溶液，添加水平为5～20 μg/mL，按1.3.3的方法将每个水平处理3份，并按1.3.1的色谱条件将每个处理液重复进样5次，经计算，腺苷的回收率在96.9%～104.1%，RSD为3.43%。

2.6 方法的精密度和样品的稳定性

将样品溶液重复进样10次，以样品峰面积计算日内RSD，结果为1.02%，说明腺苷的检测方法在该实验室的精密度很好。将样品溶液在4 ℃的环境条件下连续放置7 d，峰面积RSD为4.96%，表明样品溶液在低温贮藏时较为稳定。

3 讨论

流动相的组成对腺苷的定量检测结果影响最大[9-10]。将流动相中甲醇的浓度提高到14.5%，蛹虫草中腺苷含量的检测结果则显著增加，这与丁献荣等[8]的分析结果相似，但其结果缺少统计分析的过程，最终得出了与原方法无明显差异的结论。该试验将流动相组成、流速、吸收波长作为影响因子，将样品中腺苷含量作为因变量，对各腺苷含量的均值进行单因素方差分析和多重比较，最终得出了差异显著的结论，为试验结果的可信度及色谱条件的优化提供了科学依据。

4 参考文献

[1] FURUYA T，HIROTANI M，MATSUZAWA M.N-（2-hy-droxyethyl）adenosine，a biologically active compound from cultured mycelia of Cordyceps and Isaria species[J].Phytochemistry，1983，22（11）：2509-2512.

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[3] 刘志刚，颜仁梁，赵树进，等.不同级别人工蛹虫草腺苷含量的比较[J].药学学报，2009，25（1）：88-89.

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[9] 殷明杰，刘应竹.高效液相色谱法测定保健食品中的大豆异黄酮含量[J].中国保健，2009（22）：1074.

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