白细胞介素18和白细胞介素12对胆固醇流出的影响
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【摘要】目的 观察IL-18和IL-12对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运体A1（ABCA1)表达和胆固醇流出的影响，并探讨两者的协同效应及其调节ABCA1介导的胆固醇流出的相关机制。方法 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经不同浓度IL-18（0，2，20，200 ng/ml）或IL-12（0，0.2，2，20 ng/ml）处理或者用2ng/ml IL-12和20 ng/ml IL-18共处理不同时间（0，6，12，24h）;运用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出，高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量, 实时荧光定量PCR检测ABCA1 mRNA表达情况。结果 IL-18和IL-12单独处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞并不明显影响细胞总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯含量及细胞内胆固醇流出，但IL-12预处理或IL-18/IL-12共处理后呈浓度和时间依赖性抑制ABCA1 mRNA及蛋白质的表达。结论 IL-18/IL-12共刺激下调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达和细胞内胆固醇流出，促进细胞内脂质蓄积。
【关键词】三磷酸腺苷结合盒转运体A1 IL-18 IL-12 胆固醇流出
中图分类号：R34文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）10-009-03
Influence of IL-18 and IL-12 on Cholesterol efflux
JIANG Hailu1 LI Tong2
(1. Cardiovascular Institute of Nanhua UniversityHunan Hengyang 421001 ；2. Shenzhen Second People’s HospitalGuangdong Shenzhen 518036)
【Abstract】Objective IL-18 and IL-12, mainly produced by activated macrophages, are multifunctional cytokines which have been found to be excessively expressed in inflammatory atherosclerosis lesions.This study was to investigate the changes of cholesterol efflux, ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) mRNA and protein expression in THP-1 macrophage derived foam cells after treated by IL-18, IL-12, or both, and to discover the combined effects and mechanisms of IL-18 and IL-12 on the down-regulation of ABCA1 in foam cells. Conclusions These findings suggest that combined treatment with IL-18 and IL-12 can down-regulate the expression of ABCA1 mRNA and protein, promote the accumulation of lipid and decrease cellular cholesterol efflux in THP-1 macrophage derived foam cells.
【Keywords】ATP-binding cassette transporter A1 IL-18R IL-12 Nucleus factor-κB Cholesterol efflux
白细胞介素18（IL-18）和白细胞介素12（IL-12）是具有多种生物学功能的炎症因子，近来发现两者在动脉粥样硬化（As）斑块中过量表达。大量流行病学调查证实，血清IL-18水平与心血管疾病的风险呈正相关，提示IL-18介导了人体As病变的发生发展[1-3]。IL-12是一种与IL-18具有类似功能的炎性细胞因子，在As斑块中，IL- 12与IL-18共表达[4]。本研究观察IL-18及IL- 12作用下ABCA1表达及胆固醇流出的变化，为明确炎症与RCT的关系提供新的理论依据。
1 资料与方法
1.1 细胞培养
THP-1细胞生长于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃、5% CO2培养箱中静置培养。培养液中加10 mmol/L的HEPES、1.0×105μ/L的青霉素和100 mg/L的链霉素，取对数生长期细胞进行实验。在每次实验前用160 nmol/L的佛波酯诱导THP-1细胞24 h，使其贴壁并转化为巨噬细胞。
1.2 胆固醇流出实验
胆固醇流出检测按本实验室的常规方法进行，THP-1细胞用0.2μCi/ml[3H]胆固醇在含有10%小牛血清RPMI-1640培养液共同孵育待细胞长至85%时，用PBS液洗涤细胞，置含脂蛋白的无血清RPMI-1640培养液中培养24小时。PBS液洗涤细胞，闪烁液裂解细胞后，用闪烁计数法检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇。胆固醇流出率用培养液中CPM除以总CPM(培养液CPM+细胞CPM)，再乘以100%来表示。
1.3 高效液相色谱分析
待细胞处理结束后，弃培养基，PBS洗3遍，加入细胞裂解液200μl，反复冻融3次裂解细胞，BCA法定量蛋白后，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，800×g离心10min，取上清进行胆固醇检测,以豆甾醇为内标。取100μl上清液，加入8.9mol/L氢氧化钾溶液200μl，水解胆固醇酯后为细胞内总胆固醇检测样品。各样品分别与内标液混匀，用正己烷和无水乙醇抽提后，1.5mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥，100μl 乙晴-异丙醇（80:20）溶解样品，上样于高效液相色谱仪。采用C-18柱，柱温4℃，流速1mL/min，250nm紫外光检测，胆固醇以峰面积定量，内标校准，以mg/g细胞蛋白为单位。
1.4 细胞白的提取
弃去培养基，用冰浴PBS（含PMSF）洗涤细胞三次，用细胞刮子从培养瓶壁上刮落细胞后收集到离心管中，1000转离心5分钟，去上清液，加1ml冰浴PBS（含PMSF），洗涤沉淀，并将细胞移至Ep管，4℃ 14000转离心5min，弃上清，加入400μl冰冻的缓冲液A（10mM Hepes,1.5mM Mgcl2,10mM Kcl,1mM DTT,0.5%Np-40,100μg/ml PMSF）将细胞重悬，用移液枪将匀浆吹吸15-20次，冰上静置15min后。4℃ 14000转离心20sec，沉淀用冰浴缓冲液A洗一次，用不含Np-40的缓冲液A洗一次，同上方法离心，沉淀重新悬浮在0.5倍体积的冰浴缓冲液C（20mM Hepes,1.5mM Mgcl2,420mM Nacl,1mM DTT,0.2mM EDTA,100μg/ml PMSF）中。样品用旋涡振荡仪，振荡20分钟，14000g离心20秒，上清含细胞核提取物，放置于新的Ep管，加入等体积的冰浴缓冲液D（20mM Hepes(pH7.9), 100mM Kcl, 20%甘油, 1mM DTT, 0.2mM EDTA, 100μg/ml PMSF），立即冰冻－80℃保存。使用时，样本与SDS缓冲液一起煮沸后，-20℃ 保存备用。
1.5 统计学分析
实验所得数据采用均数±标准差（x±s）表示。用SPSS 12.0进行统计处理，组间比较采用方差分析及t检验, 以P＜0.05判定差异的显著性。
2 结果
2.1 IL-18对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响
THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经不同浓度（0，2，20，200 ng/ml）IL-18处理24h后，提取细胞总RNA和蛋白，通过实时荧光定量PCR和Western blot测定细胞内ABCA1基因和蛋白质表达的变化。结果显示，用IL-18单独处理细胞，ABCA1 mRNA和蛋白表达无显著变化（图1）。
图1 不同浓度IL-18对ABCA1 mRNA表达的影响（n=3）
*P＞0.05 vs 0ng/ml组
2.2 IL-12对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响
THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经不同浓度（0，0.2，2，20 ng/ml）IL-12处理24h后，提取细胞总RNA和蛋白，通过实时荧光定量PCR和Western blot测定细胞内ABCA1基因和蛋白质表达的变化。结果显示，用IL-12单独处理细胞，ABCA1 mRNA和蛋白质表达无显著变化（图2）。
图2 不同浓度IL-12对ABCA1 mRNA表达的影响（n=3）
*P＞0.05 vs 0ng/ml组
3 讨论
近年来，越来越多的研究证明动脉粥样硬化（As）具有慢性炎症疾病的病理生理过程，在As斑块中大量的炎性细胞浸润和炎性因子的表达促进斑块的发生、发展和破裂[5]。流行病学调查研究显示，高密度脂蛋白（high density lipid，HDL）水平与As相关的心血管疾病的风险呈负相关，其主要抗As的机制与HDL促进胆固醇逆向转运（RCT）有关[6]。RCT是将外周胆固醇转运到肝脏进行代谢的过程，其中HDL的主要成分载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA1-I）通过ABCA1促进巨噬细胞内胆固醇流出是RCT的关键环节[7]。最近的研究显示，炎症反应抑制体内RCT，可能为炎症促进As提供理论基础。然而，炎症影响RCT的具体机制还有待进一步阐明，其中炎症状态下脂质转运体ABCA1的表达变化可能是其关键机制[8-9]。ABCA1的表达受到多因素多水平的调控。在转录水平，多种促炎细胞因子，如TNF-α[10]、IL-1β[11]、C反应蛋白（CRP）[12]和IFN-γ[13]等通过LXR下调ABCA1的表达，从而抑制胆固醇的流出。在转录后水平，促炎蛋白，如LPS[14]、EPA[15]、钙蛋白酶[16]和钙调蛋白[17]等通过下调ABCA1的稳定性促进其降解，这些研究提示炎症状态下ABCA1的表达受到多种因素调节。
IL-18和IL-12是在As斑块中过量表达的炎症细胞因子，两者的水平与心血管疾病的风险呈正相关[18-20]。IL-18属于IL-1超家族成员，目前认为其是内源性和获得性免疫炎症反应的重要调节子[21]。IL-12由IL-12p40、IL-12p35两个亚基组成的，其中IL-12p35普遍表达于各类细胞，而IL-12p40主要表达于免疫细胞。在静止状态下，各种细胞中的IL-12p35是很微量的，在免疫反应时，IL-12p40可大量合成[22]。IL-12具有类似于IL-18的功能，对IL-18的生物学功能具有协同效应，两者的协同作用对于诱导IFN-γ等炎症因子的表达[23, 24] 、启动Th1反应[25, 26]和树突状细胞（DC）成熟[27, 28]等具有重要作用。虽然IL-18最初的功能被认为与诱导IFN-γ有关，然而最近的研究显示IL-18具有多种促As的功能。生理状态下，IL-18及其受体主要在血管平滑肌细胞和内皮细胞表达，炎症细胞表达IL-18R相对较少。但在As斑块中IL-18及其受体过量表达，尤其在巨噬细胞中表达明显。在血管平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中，IL-18诱导IL-6、IL-8、ICAM-1和基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，而且，与IL-12共同作用后，IL-18能促进平滑肌细胞IFN-γ的表达，这些作用对于As的形成具有重要意义[29]
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