mGluR1在苯并(a)芘致神经细胞损伤中的表达

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【摘要】目的 研究代谢型谷氨酸受体第1亚型(mglur1)在苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)染毒大鼠脑神经细胞中的表达情况。方法 通过体外培养大鼠神经细胞并用不同浓度B[a]P染毒,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,观察细胞的生长状况和分子生物学改变。①光镜观察神经细胞的形态学变化;② RT-PCR法检测mGluR1基因的表达情况。结果 ①光镜下可见神经细胞形态改变,随B[a]P剂量的加大可见神经细胞的突触数量明显减少、突触长度缩短和神经细胞包体间以及包体与突触间的连接减少;②与对照组相比,各组mGluR1基因的检测结果无统计学意义(P>0.05),各剂量组对照组相比随着B[a]P剂量的加大mGluR1的表达有上升趋势。结论 ①B[a]P能够诱导神经细胞的损伤,且其损伤程度与B[a]P的作用剂量有密切关系;② mGluR1在苯并(a)芘致学习记忆损伤的机制中可能不起主要作用。

【关键词】苯并(a)芘;mGluR1;神经细胞损伤

中国分类号:R114文献标识号:A 文章编号:1005-0515(2010)10-060-03

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是人类最早发现的环境污染物和致癌物质,普遍存在于空气、食物和饮用水中。苯并(a)芘作为PAHs的主要代表之一,主要来源于煤、木材、油和烟草的不完全燃烧,广泛存在于烹调油烟冷凝物、油烟颗粒物以及烧烤烤肉等食物中,不仅有致癌性,导致DNA损伤,而且与人群生殖健康以及不良出生结局的发生有密切关系[1]。苯并(a)芘可以对职业接触人群的学习,记忆,感知觉等产生不利的影响[2] 。B[a]P对学习记忆功能有损伤作用,可能与神经细胞凋亡有关。mGluR1是学习记忆过程中的重要信号分子,与神经细胞的凋亡也密切相关。因此,本课题主要通过动物神经细胞体外培养途径,研究mGluR1在B[a]P染毒SD大鼠脑神经细胞中的表达情况,观察mGluR1在苯并(a)芘致学习记忆损伤中的作用机制中是否起主要作用。

1 实验材料

1.1药物与试剂

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基购自Gibico公司;胰酶(Trypsin)购自北京邦定生物医学公司;多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine, MW 30000-70000)购自Sigma公司;谷氨酰胺,购自北京夏斯生物公司;HEPES购自北京拜尔迪生物公司; Cell Counting Kit8,购自日本同仁化学研究所; RNAiso Plus;Tris,购自上海生工生物工程有限公司;mGluR1及β-actin引物序列均由北京赛百盛公司设计合成; cDNA第一链合成试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自太原市东弘科贸有限公司。

1.2 实验仪器

①二氧化碳培养箱德国Heraeus 公司生产;②SW-CJ-2F型超净工作台苏州安泰空气技术有限公司生产;③ KY-I 型微型空气压缩机 绍兴市卫星医疗设备制造有限公司生产;④80-2B型离心沉淀机 盐城市科学仪器厂;⑤LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备厂;⑥Neofuge 15R台式高速冷冻机 上海力申科学仪器有限公司;⑦EDC-810型基因扩增仪 东胜创新生物科技有限公司; ⑧DYY-8C型电泳仪,DYC-40C型电泳槽 北京市六一仪器厂;⑨专业数码凝胶成像与分析系统 3.3 江苏捷达科技;⑩AB104-N电子天平上海电子仪器厂生产。

2 方法与结果

采用新生1-3天的SD大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供),在无菌条件下取出脑皮质并用0.25%胰酶消化,以1×105密度接种神经细胞,培养5天。用B[a]P对细胞染毒,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,使其终浓度为0μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L,继续培养48h ,观察细胞的生长状况。①光镜观察神经细胞的形态学变化;② RT-PCR法检测mGluR1基因的表达情况。实验结果用均数±标准差( ) 表示, 用SPSS for 11.0 版本软件进行统计学分析,采用单因素F 检验判断均数差异显著性。

2.1神经元细胞染毒后形态学变化

在光学显微镜下观察神经细胞可见,对照组神经细胞具有呈圆锥形的长突起,轴突长且比较均一,树突数量多,细胞与突触间,胞体与胞体间连接丰富。低剂量组在形态上仅见包体变大,部分神经元轴突变短,细胞间连接减少。中剂量组神经元的细胞变形,轴突变短,且树突的数量减少,细胞与突触间,胞体与胞体间连接减少。高剂量组神经元树突数量进一步减少,轴突减少变短,细胞与突触间,胞体与胞体间连接明显减少;见图1-5。

2.2 mGluR1的RT-PCR检测结果

由表2数据可知,经统计学分析各均数间无差异,但除中剂量组外,与对照组相比mGluR1基因的表达量随着B[a]P剂量的增大有上升趋势。

3 讨 论

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)是一种常见的环境化学致癌物,可通过生物链累积。B[a]P及其代谢物可透过血脑屏障,也可通过嗅神经直接进入大鼠脑组织,并在小脑等部位蓄积[3],引起神经递质含量及其代谢酶活性的改变,致全脑单胺能、多巴胺能和血清素能系统变化,导致行为和激素分泌障碍 。B[a]P作为一种慢性神经毒性物质,可使神经系统发生退行性改变,已经被许多动物实验所证实。Andersson等发现汽车尾气提取物(含B[a]P)注射大鼠海马及脑干部位可造成组织细胞损伤[4]。波兰的一项调查表明,焦化工人出现神经官能症,伴有植物神经系统的调节紊乱,并出现短期记忆的缺失,其严重程度与接触B[a]P的水平有关[5]。整体动物实验脑室注射苯B[a]P可显著性的引起海马神经细胞的减少,随着所给B[a]P剂量增加海马神经细胞凋亡增多。本研究中在以不同浓度的B[a]P染毒大鼠神经细胞时,光镜下可见细胞形态改变,B[a]P作用剂量的加大可见神经细胞突触长度明显缩短,并且神经细胞间和细胞与突触间的连接数量及损伤程度也与B[a]P的剂量有着密切的关系。说明B[a]P的作用可以导致神经细胞损伤,并且损伤的程度与B[a]P的作用剂量有着密切的关系。

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内的主要神经递质,约50% 的谷氨酸参与调节中枢神经系统内的突触传递,几乎可调节正常脑内的所有功能,包括学习、记忆、运动、认知和发育,并与神经细胞的存活、突触的形成及可塑性密切相关。代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamatere2 receptors, mGluRs) 属于G蛋白偶联受体(G p rotein coupled receptor GPCRs) 超家族中家族C的成员。依据其蛋白序列同源性、受体偶联的第二信使系统、以及对不同激动剂的特异性, 已将这些受体分为3 类: Ⅰ组mGluRs 包括mGluR1 和mGluR5; Ⅱ组mGluRs包括mGluR2 和mGluR3;Ⅲ组mGluRs包括mGluR4、mGluR6-8。

Ⅰ组代谢型谷氨酸受体激动剂GHPG通过增加PLC表达可保护谷氨酸引起的迟发性细胞死亡;也可调节NMDA受体的兴奋毒性,降低神经细胞的凋亡[6,7] ,在记忆、学习和突触传递效率的可塑性变化等生理过程中起着重要作用。出生于上世纪八十年代捷克儿童的学习记忆障碍同孕期接触环境中高水平的苯并(a)芘等多环芳烃类物质有关[8]。动物实验研究发现,亚急性B[a]P腹腔注射可导致大鼠逃避学习记忆和空间记忆能力的损伤。在小脑皮质平行纤维突触中应用Quis导致Purkinje细胞去极化和突触的LTD,提示mGluR1活化与突触可塑性有一定关系。而LTD在mGluR1缺乏的小鼠中严重缺陷,并且mGluRs特异抗体可阻断Purkinje细胞LTD发生[9]。有研究表明,I组mGluR的拮抗剂MCPG能减弱空间学习能力,4-CPG在体内能部分地阻断LTP及减弱学习和记忆的能力,而其激动剂t-ACPD 能增强记忆力[10]。本研究通过RT-PCR法就mGluRl在不同剂量组B[a]P染毒大鼠神经元细胞中的表达情况进行了初步研究,研究结果虽无统计学意义,但与对照组相比,不同剂量组mGluRl表达量有上升趋势,提示mGluRl在苯并(a)芘致学习记忆损伤的机制中可能不起主要作用。

参考文献

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