嗅三针对血管性痴呆大鼠大脑边缘叶神经元超微结构的保护作用

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摘要 目的：探讨“嗅三针”电刺激治疗并经行实验研究，观察电刺激后血管性痴呆大鼠大脑边缘叶神经元超微结构的保护作用，为改善嗅觉系统能够治疗血管性痴呆的临床应用提供理论支持，也为探讨其治疗机理奠定基础。方法：SD大鼠60只，分为VD模型组、嗅三针组和正常对照组。嗅三针组给予“嗅三针”电刺激，频率80一100Hz，强度1－3mA，持续60min。进行水迷宫学习记忆能力行为学测试、透射电镜观察和线粒体体视学检测。结果：VD模型组大鼠大脑边缘叶神经元线粒体的面积、周长、直径均比正常对照组明显增大(P

关键词　血管性痴呆大鼠　大脑边缘叶神经元　超微结构　嗅三针

随着我国社会老龄化的进程，VD的发病率也在逐年上升，严重影响着老年人的生活质量，因其发病率、致残率、病死率均较高，故已成为威胁高龄人群生命的重要疾病 ，并给社会和家庭带来了沉重的负担。实验研究已经证实，头部电针刺激能有效地干预大鼠急性脑缺血再灌注所引发的一系列病理过程。大鼠的嗅觉系统发达，其中枢部位突出于大脑前端，易于定位。我的导师刘智斌教授设计了大鼠头部“嗅三针”电刺激方法，通过刺激嗅觉系统来改善VD大鼠的痴呆症状，研究成果显著。我们在试验中，通过“嗅三针”电刺激观察其对血管性痴呆大鼠大脑边缘叶神经元超微结构的保护作用，并探讨其作用机理。

1材料与方法

1，1 动物及分组　健康Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，体重280～310g／每只，由西安交通大学实验动物中心提供。造模后随机分为3组，每组10只。①VD模型组：制作大脑中动脉缺血再灌注模型；②嗅三针组：脑缺血模型加“嗅三针”电刺激；③正常对照组：手术步骤同模型组，行同样手术但不灼烧椎动脉，不夹闭颈内动脉，术后饲养4周。

1，2动物造模按照经典的四血管阻断(4-Vesselocclusi on，4-VO)方法制作血管性痴呆模型。用10％水合氯醛(0.3mL／100g体重)腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌操作。颈部背侧后正中切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝烧灼双侧椎动脉，造成永久陛闭塞。24h后，颈部腹侧前正中切口，分离双侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈内动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。手术部位施以适量青霉素抗感染，仔细缝合，常规饲养。

1，3治疗方法术　后第二天，随机分组后即给嗅三针组治疗，正常对照组和VD模型组同等条件下饲养，未予任何治疗。“嗅三针”配穴：两侧迎香及印堂穴。迎香穴：大鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；印堂穴：大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。操作：选用“华佗牌”不锈钢针，30号0.5寸毫针。迎香穴向内上方斜刺0.3cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3cm；电针仪：G6805电针仪，上海医疗仪器厂出品；刺激参数：疏密波，频率80～100Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度(电流强度：1-3mA，电压：1～3V)。时间：留针20min，留针其间行针两次，行针手法用平补平泄手法，持续电刺激，每日1次。5日为1个疗程，休息2天，共进行6个疗程。

正常对照组及VD模型组，每日1次采取与嗅三针组相同的捉拿固定，但不施加任何干预措施。

1，4标本采集及处理实验终点将动物给予4％多聚甲醛灌注30min。断头取脑放入4％多聚甲醛后固定。线粒体体视学检测采用德国莱卡公司图像信号采集与分析系统。

透射电镜样品制作过程：样品取出后切成1mm3的小块，立即置于2.5％的戊二醛固定液中4℃固定2小时以上，反复浸透、包埋，聚合后做半超薄切片1-2μ，美兰染色后光学显微镜下定位，瑞典LKB-V型超薄切片(瑞典LKB公司)50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，日本电子JEM-100SX透射式电子显微镜下观察、拍照。

1，5投射电镜观察大脑边缘叶等脑组织内超微结构的形态改变采用透射式电子显微镜(日本电子公司JEM-100SX)检测。超薄切片后，在透射电镜下观察切片上细胞形态及超微结构的改变并摄片。JEM-100SX透射式电子显微镜：日本电子总公司产品。

1，6线粒体体视学检测 线粒体体视学检测采用德国莱卡公司图像信号采集与分析系统测定线粒体的面积(area)、周长(circumference)、直径(diameter)。检测方法参考相关文献。

1，7统计学处理所有数据用SPSS16.0统计学软件进行统计，计量资料的数据以均数±标准差(±s)表示，多组均数间差异性检验用单因素方差分析，以P

2结果

投射电镜观察及线粒体体视学检测均一致显示，大脑边缘叶等脑组织内神经元超微结构在正常对照组、VD模型组、嗅三针组之间有显著差异。

2，1 电镜观察结果正常对照组：神经元体积较大，细胞核圆形，表面光滑，核内染色质分布均匀，常染色质丰富，异染色质较少，核仁大而明显，居中；细胞质内细胞器丰富，高尔基复合体发达，线粒体体积较小，结构清晰，分散在细胞质内，大量密集的粗面内质网堆叠排列，游离核糖体丰富，溶酶体少量。

VD模型组：神经元肿胀明显，电子密度降低，细胞核圆形，核内染色质松散；细胞质内出现灶状溶解，部分区域空化明显，细胞器减少，线粒体明显肿胀，嵴断裂、溶解，部分成空泡样结构，粗面内质网扩张并有脱颗粒现象。

嗅三针组：神经元数量较少，细胞核圆形，表面较光滑，细胞核内染色质分布均匀，常染色质丰富，异染色质较少，核仁居中；细胞质内细胞器丰富，可见到高尔基复合体、线粒体及粗面内质网，游离核糖体丰富，溶酶体少量，线粒体轻度肿胀，结构基本正常。详见图1。

2，2线粒体体视学检测结果vD模型组大鼠大脑边缘叶神经元线粒体的面积、周长、直径均比正常对照组明显增大(P

从以上数据可以看出通过嗅三针针刺的治疗对血管性痴呆大鼠大脑边缘叶线粒体等超微结构有很好的保护作用。

3讨论

血管性痴呆属中医学痴呆病范畴。本病的形成以内因为主，多由于年迈体虚、七情内伤、久病耗损等原因导致气血不足，肾精亏耗，脑髓失养，或气滞、痰阻、血瘀于脑而成。本病为一种全身，陛疾病，其基本病机为髓海不足，神机失用。由精、气、血亏损不足，髓海失充，脑失所养，或气、火、痰、瘀诸邪内阻，上扰清窍所致。痴呆病位主要在脑，与心、肝、脾、肾功能失调密切相关。病理性质多属本虚标实之候，本虚为、气血亏虚，标实为气、火、痰、瘀内阻于脑。嗅觉系统主要由嗅上皮、嗅神经、嗅球、嗅束和嗅皮质组成。嗅觉系统具有下述特点：①仅由两级神经元组成，在鼻腔与嗅觉中枢之间无血脑屏障；②嗅觉系统富含多种神经介质和神经调节剂参与嗅觉传导；③嗅觉中枢位于颞叶、杏仁核及梨状区皮质(包括海马旁回前部、钩及其附近的皮质)，这正是vD早期病理改变所在区域。

嗅三针指印堂与迎香穴。定位：依据针灸学教材取穴标准，在双侧迎香穴进针向内上方透刺至上迎香穴，第三针从两阳白穴连线中点透印堂至鼻根。迎香穴是治疗嗅觉障碍的有效穴位，在此穴位作延伸透刺能够增强对嗅觉的刺激作用。鼻为嗅觉器官，嗅三针均临近鼻部，符合局部取穴原则。从现代医学解剖学角度来看，嗅三针电刺激通过血管、神经途径与嗅觉系统有密切联系。

通过本实验研究发现，嗅三针能改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力，对大脑边缘叶超微结构尤其是线粒体有一定的保护作用，对血管细痴呆大鼠具有一定的治疗作用。其治疗血管性痴呆的作用机理可能是通过以改善神经元细胞功能或增强对大脑边缘叶超微结构的保护作用等有关。