HPLC-荧光法测定替米沙坦血药浓度的方法学考察
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[摘要] 目的：采用hplc-荧光法测定替米沙坦的血浆药物浓度。方法：采用Agillent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为水-乙腈（58∶42，H3PO4调pH为4~5），流速1.0 ml/min，荧光激发波长300 nm，发射波长380 nm。结果：替米沙坦浓度在5~200 ng/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系，最低检测限为5 ng/ml。结论：该法准确可靠，适用于替米沙坦的血药浓度测定。
[关键词] 替米沙坦；血药浓度；HPLC
[中图分类号]R927.2 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）03（b）-028-02
Determination of telmisartan in human plasma by HPLC-fluorescence
WANG Xiao-hong, SUN Hong-liang, KONG Deng
(Department of Basic-medicine Teaching,Weifang Medical College,Weifang 261042,China)
[Abstract] Objective:To determine the concentration of telmisartan in human plasma by HPLC-fluorescence method.Methods:Separation was achieved on Agillent Zorbax SB-C18 column（150 mm×4.6 mm,5 μm）.The mobile phase consisted of water-acetonitrile(58∶42, pH4~5),with a flow rate of 1.0 ml/min,and detection with a fluorescence detector set at an excitation wavelength of 300 nm and emission wavelength of 380 nm. Results:A linearity of telmisartan concentration curve was obtained in a range of 5~200 ng/ml.The detection limit was 5 ng/ml.Conclusion:This method is accepted to determine the concentration of telmisartan.
[Key words] Telmisartan;Blood-plasma concentration;HPLC
替米沙坦(telmisartan)为一种新型非肽类血管紧张素受体阻滞剂，可选择性地难逆转性地阻滞AT受体，而对其他受体，尤其是心血管系统的受体无影响，是一种长效、高效、低毒的新型降压药[1]。由于替米沙坦在人体内的血药浓度很低，近年来对其的测定主要有同位素14C标记法、HPLC-MS法[2]、放射免疫法(RIA)等。本文采用HPLC-荧光法测定替米沙坦的血浆药物浓度，实验中所用的血浆样品为体外配制，旨在用最灵敏、有效、简洁的方法测出最低检测量的药物浓度，为临床替米沙坦血药浓度监测提供借鉴。
1 仪器与试药
Agilent-1100高效液相色谱仪(配有DAD，美国)；荧光检测(FLD)G1321A；微量进样器(25 μl，Hamilton美国)；微量分析天平(Mettler Toledo AL204瑞士)；KQ3200超声波清洗器(120 W，40 kHz，江苏昆山)。
替米沙坦对照品（含量99%以上）；甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher，美国）；水为杭州娃哈哈集团纯净水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1色谱条件
Agillent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为水-乙腈（58∶42，H3PO4调pH为4~5），流速1.0 ml/min，荧光激发波长300 nm，发射波长380 nm。柱温：室温。在此色谱条件下，理论塔板数（按替米沙坦峰计）应不低于6 000。
2.2溶液的配制
精密称取替米沙坦对照品4 mg置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得160 μg/ml的替米沙坦贮备液，置4℃冰箱中保存。将贮备液用甲醇逐级稀释，配制浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 μg/ml的替米沙坦标准液。
2.3血浆样品的制备
将新鲜冰冻血浆融化后精确量取0.36 ml于1 ml EP管中，分别加入不同浓度的替米沙坦标准溶液40 μl，按照“2.4”项下进行操作。
2.4 血浆样品的处理
取血浆样品0.4 ml加入等体积的乙腈，漩涡混合30 s，10 000转/min离心10 min，过滤后取上清液20 μl直接进样，按“2.1”项色谱条件下测定，空白血浆中内源性杂质对替米沙坦色谱峰无干扰，替米沙坦峰分离良好，保留时间为5.875 min。
2.5线性关系的考察
取不同浓度的替米沙坦标准液40 μl加入0.36 ml空白血浆，使血浆样品浓度分别为 5，10，20，50，100，200 ng/ml，按“2.4”项下操作，记录色谱峰及峰面积。以测定的峰面积(Y)为纵坐标，对应替米沙坦浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。测得回归方程为：Y=0.722 5X+0.499 1，r=0.999 9(n=6)，替米沙坦浓度在5~200 ng/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系，最低检测限为5 ng/ml。
2.6 回收试验
取空白血浆，加入替米沙坦对照品贮备液(160 μg/ml)适量，使成为低、中、高3种不同浓度(10，50，200 ng/ml)的溶液，按“2.4”项下方法处理后进样测定，结果见表1。
2.7 日内精密度及日间精密度
取空白血浆，加入替米沙坦对照品贮备液(160 μg/ml)适量，使成为低、中、高3种不同浓度(10，50，200 ng/ml)的溶液，按“2.4”项下方法处理后进样测定。结果3种浓度的日内RSD分别为1.11%，1.43%，0.92% (n=6)，日间RSD分别为3.08%，2.02%，1.57%(n=6)，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
在室温条件下，考察替米沙坦的稳定性。分取3种已知不同浓度的替米沙坦的血浆样品，置室温、冰冻条件下存放不同时间后，按“2.4”项下方法处理并测定替米沙坦含量。结果表明，替米沙坦血浆样品在室温条件下15 h内稳定，冰冻条件下至少能稳定48 h。
3 讨论
文献报道[3]，替米沙坦激发波长为295 nm，发射波长为365 nm，但在此检测条件下，拉曼光影响较严重，无法与药物峰完全分离，本实验采用的激发波长为300 nm，发射波长为 380 nm，可以消除拉曼光的影响，提高药物的最低检测限；同时，此波长下，血浆中的干扰物质吸收度也较小。色谱条件采用乙腈-水不同的配比为流动相，但色谱峰有拖尾现象，加入三乙胺也未能改善，最后采用文中的方法，色谱峰峰形好，分离度高，且血浆中内源性杂质对替米沙坦色谱峰无干扰，可以用于替米沙坦血药浓度的HPLC测定。
血浆样品测定中样品的预处理是影响结果好坏的关键。本实验采取在酸性条件下乙腈沉淀血浆蛋白，乙腈与血浆体积比为1∶1，高速离心后上清液直接进样，操作简便，且沉淀剂与流动相中有机成分相同，由此造成的干扰少。故综合考虑，采用本实验的操作方法。
本实验开始采用 1 ml ODS固相萃取小柱处理血样，操作比较繁琐，过程复杂，误差增大，回收率不理想，故未采用。
[参考文献]
[1]张瑾,陈绍行.血管紧张肽Ⅱ受体拮抗剂的药动学与临床用药[J].中国新药与临床杂志,2004,23(2): 111-115.
[2]J Stangier, Su CA，MD．Pharmacokinetics of repeated oral doses of amlodipine and amlodipine plus telmisartan in healthy volunteers[J].J Clin Pharmacol,2000,40:1347-1354.
[3]王健康,王峰,张华峰,等.反相高效液相色谱法测定人血浆中替米沙坦片的浓度[J].药学学报,2004,20(2): 138.
（收稿日期：2007-11-21）
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