名贵中药无花果的器官克隆和快速繁殖

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摘要：目的：为了实现无花果的组织培养，以无花果（Ficus carica L.）当年枝生顶芽或叶芽为外植体，以无花果的幼嫩茎为材料，采用植物组织培养方法[1～3]，进行愈伤组织诱导、分化、等研究。方法：采用培养基的浓度为MS1/2 MS+NAA 1 mg/L+2，4-D1mg/L，6-BA 0.5mg/L 的组合以及10min的外植体消毒时间，进行实验，观察不同组织的愈伤组织生成率。结果：在叶片、叶柄、嫩茎、芽四种组织中，嫩茎的愈伤组织诱导率最高，形成不定芽的比率也最高，其次是芽和叶片，叶柄的愈伤组织诱导率以及成活率最低。结论：为快速繁殖提供了理论基础[4～8]。

关键词：快速繁殖 无花果 组织培养

无花果，属桑科植物，一名奶浆果，原产亚洲西部，现在新疆、四川、江苏、山东、河南等地均有种植。[性味]：果性平味甘，叶淡色平。无花果的根叶、果均可入药[7]。

无花果的功效：

（1）无花果含有苹果酸、柠檬酸、脂肪酶、蛋白酶、水解酶等，能帮助人体对食物的消化，促进食欲，又因其含有多种脂类，故具有润肠通便的效果；（2）无花果所含的脂肪酶、水解酶等有降低血脂和分解血脂的功能，可减少脂肪在血管内的沉积，进而起到降血压、预防冠心病的作用；（3）无花果有抗炎消肿之功，可利咽消肿；（4）未成熟果实的乳浆中含有补骨脂素、佛柑内酯等活性成分，其成熟果实的果汁中可提取一种芳香物质苯甲醛，二者都具有防癌抗癌、增强机体抗病能力的作用，可以预防多种癌症的发生，延缓移植性腺癌、淋巴肉瘤的发展，促使其退化，并对正常细胞不会产生毒害。

孕妇宜常吃适量的无花果。因为无花果不仅有丰富的营养成分，还能够治疗痔疮及通乳。中国医学在长期的临床实践中总结无花果的性质平和，味甘，能够健胃，清肠，消肿解毒，可以用来治疗肠炎，痢疾，便秘，痔疮，喉痛及痈疮疥癣等。

无花果的药理作用：

（1）无花果含丰富的营养成分，供食用。在便秘时，可用作食物性轻泻剂。树的乳胶汁中含有抑制大鼠移植性肉瘤之成分（注射时）。（2）干果的水提取物经活性炭、丙酮处理后所得之物质有抗艾氏肉瘤的作用。（3）从未成熟果实中所得的乳汁能抑制大鼠移植性肉瘤、小鼠自发性乳癌，致使肿瘤坏死；又能延缓移植性腺癌、骨髓性白血病、淋巴肉瘤之发展，使其退化。将此乳汁静脉注射0.02ml（大鼠）或0.05ml（兔），可使动物立即死亡，解剖可见内脏毛细血管损害；腹腔注射之情况相似；皮下注射可引起局部坏死；口服则无毒。

化学成分：含枸橼酸、延胡索酸（fumaric acid）、琥珀酸、丙二酸、脯氨酸、草酸、苹果酸、莽草酸（shikimic acid、奎尼酸（quinic acid）、生物碱、甙类、糖类、无花果朊酶（ficin）等。[摘录]《全国中草药汇编》。由于其有重要的药用价值且可作为一种水果食用，因此对无花果的快速大量繁殖，大规模的种植具有一定的商业效益。由于无花果的普通繁殖耗时比较长，繁殖率不高，因此我们队无花果的组培快速繁殖技术进行研究，实现无花果的快速繁殖[8～14]。

1、材料与方法

1.1 材料

（1）外植体的选择：在春季四月中旬采取曲阜师范大学的无花果（Ficus carica L.）的有嫩茎为外植体。

（2）药品：一是、固体药品：NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO3、FeSO4.7H20、EDTA、KI、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuSO4.5H2O、MnSO4.H20、CoCl2.6H20、ZnSO4.7H2O、2，4-D、NAA、肌醇、烟酸、维生素B1、甘氨酸、维生素B6、蔗糖、琼脂、NaOH、HgCl2、无水乙醇等。二是、液体试剂：无菌水（最好制取出的无菌水放置时间不要太长，否则会重新有细菌进入，所以最好现用现制）

（3）器材：烧杯（10ml、20ml、100ml、1000ml等）、玻璃棒、量筒（5ml、10ml、20ml、100ml、1000ml等）、胶头滴管、试剂瓶、冰箱、电子天平、水浴锅、电磁炉、培养瓶、无菌操作台、酒精灯、火柴、药匙、剪刀、镊子、废水桶、记号笔等。

（4）溶液的配置：

第一、20倍大量元素溶液的配置：

NH4NO3 330g/10L， KNO3 380g/10L，

CaCl2.2H2O 88g/10L， MgSO4.7H2O 74g/10L

KH2PO3 34g/10L。

第二、螯合铁200倍液：

7水硫酸亚铁11.12g/2L和乙二酸四乙酸二钠14.8 g/2L。

第三、50倍微量元素的配置：

KI 4.15mg/1L Na2MoO4.2H2012.5mg/1L

3BO3310mg/1LCuSO4.5H2O1.25mg/1L

MnSO4.H20 845mg/10L CoCl2.6H201.25mg/1L

ZnSO4.7H2O 430 mg/1L

第四、MS有机化合物溶液的配置：

肌醇 20 g/L烟酸0.1g/L

维生素B1 0.1g/L 甘氨酸 0.4g/L

维生素B6 0.1g/L

第五、2，4-D1.0mg/L 6-BA0.5mg/L

第六、NAA0.50mg/L

将上述配置好的溶液倒入容量瓶中，放入冰箱内保存。

第七、培养基的配置：

先在锅中放入500ml水，按如下的体积加入八种母液：

各种溶液的体积：

大量元素：117 ml 微量元素46.8ml

MS铁盐母液 11.7 ml 2，4-D 23.4ml

NAA 23.4ml MS有机化合物溶液11.7ml

然后再加水1670ml，再加上琼脂粉18.72g，蔗糖70.2g。放在电磁炉上边加热边搅拌至溶解。用NaOH调PH至5.8待琼脂粉融化后，分装至培养瓶中，每个培养瓶中的培养基厚度约为1.5cm。盖好盖子后，放入消毒灭菌锅中灭菌121℃，灭菌30min，以杀死培养基中的细菌，使培养基保持无菌的环境。灭完菌后，再取出。取出的培养基放在超净工作台上。

1.2 方法

从生长健壮的无花果植株上剪取带有顶芽或、腋芽的半木质化枝条，先在流水下冲洗干净后，再在超净工作台上用无菌水冲洗，然后用0.1%的HgCl2溶液浸泡10min（摇晃盛有无花果组织的消毒瓶，以除去无花果组织表面的气泡，防止灭菌不充分），然后用无菌水冲洗6～8次，最后用灭过菌的滤纸擦干净起表面的水分。将无花果的嫩芽及叶剪成0.5～1cm长的段，接种在MS培养基上进行无菌培养。每个培养瓶中接种10个无花果组织块。将培养瓶放于培养室内培养，培养室内的温度为22～25°C。愈伤组织的诱导和不定芽的分化的培养基中蔗糖含量30g/L，pH5.8。不同时间观察愈伤组织的生长状况，并记录。

2、分析

结果分析：本次试验一共接种了8瓶无花果的各种组织，每瓶接种了10块组织，其中有一瓶有轻微的污染，估计应该与接种时操作有关。在叶片、叶柄、嫩茎、芽四种组织中，嫩茎的愈伤组织诱导率最高，形成不定芽的率也是最高，其次是芽和叶片，叶柄的愈伤组织诱导率以及成活率最低，估计可能与叶柄比其他组织细长，与培养基的接触面积小有关。另外，叶柄上有细小的绒毛，会导致细小的气泡去除不干净而留在叶柄上，这些空气泡泡中存在细菌，导致了染菌，是愈伤组织的形成率降低。在整体的方面，第一周叶片、嫩茎、芽可见愈伤组织，叶柄愈伤组织太小，几乎不可见。第二周，可能由于消毒不彻底的原因，有的培养基上开始长菌斑导致被细菌包围的组织块不能再继续生长成愈伤组织，或者是已经形成愈伤组织的组织块停止生长，叶柄的染菌率最高，绝大多数细菌斑都是从叶柄的组织块附近生长出来的，没有染菌的愈伤组织继续生长，组织块的体积继续变大，组织块的颜色变为深黄绿色。第三周，染菌的培养瓶中菌斑继续变大，原来没有被细菌包围的愈伤组织被包在菌团的内部而停止生长，没有染菌的愈伤组织表面略见突起，有再分化生成芽的趋势。随着培养瓶放置时间的增长，逐渐有细菌进入培养瓶内部，使得生长良好的愈伤组织被染菌而停止生长，本次试验只是进行到愈伤组织表面可以见到一系列大小不等的芽状突起就结束，并没有进行一系列的后续工作。

3、讨论

关于染菌的问题：在整个操作过程中，培养皿以及培养基的灭菌彻底对以后的培养过程是至关重要的。此外，用HgCl2 对组织进行消毒时，要不断的摇晃消毒瓶，以除去组织上的气泡（因为组织上的气泡里会带有细菌，有气泡会导致消毒不彻底，培养过程中染菌）。在用剪刀和镊子对无花果的组织进行剪切处理时，镊子和剪刀应先蘸酒精，然后在酒精灯上灼烧，使镊子和剪刀上所带的细菌被完全杀死，这样就不会因为由于镊子或者剪刀上带的细菌导致外植体染菌，进而提高愈伤组织的成活率。外植体接种后不能打开瓶盖，只能戴盖观察，以防染菌。整个无花果的组织接种过程是在无菌操作台上进行的，实验中所用的各种试剂也都是用无菌水配制的，这样就尽量避免了各种可能染菌的情况，尽量降低染菌率。细菌在培养基上是很容易生长的，一旦培养基上有细菌，细菌就会大量繁殖，在很短的时间内，就会导致整个培养基上都长满了细菌，外植体就不能在培养基上生存，所以，整个过程中必须得严格控制染菌，排除一切染菌的可能性。在无菌操作台上进行外植体的接种工作时，操作人员最好佩戴口罩，尽量少说话。手用酒精消毒后，不能拿出无菌操作台所能保持的无菌范围以外的地方，不能乱抓，有其他无关的动作，比如挠头等动作，以避免染菌。接种完，培养瓶的盖子要扣严，如扣不严，细菌就会从缝隙处进入到培养瓶中，造成染菌，导致最终的愈伤组织诱导率降低，影响实验结果。

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