M2、M3受体自身抗体在肺心病发病中的作用
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摘要：目的探讨肺心病痛人抗m2、m3受体自身抗体的产生、作用及其与右心结构的关系。方法 用SA－ELISA法对108例肺心痛病人和30名健康人血清中抗M2、M3受体自身抗体进行检测，并与血气分析及心脏超声学检查结果进行比较。结果肺心病组病人血清抗M2、M3受体自身抗体的阳性率及平均几何滴度[48.15％，80(1.846±0.351)；40.74％，53(1.725±0.273)]均高于对照组[13.33％，40(1.602±0.369)；10.00％，20(1.301±0.000)](P＜
关键词：肺心病；M2受体自身抗体；M3受体自身抗体
中图分类号：R541.5 R256.2 文献标识码：B 文章编号：1672―1349(2007)04―0295―03
长期以来慢性肺源性心脏病(简称肺心病)研究主要集中在缺氧导致肺动脉高压引起肺心病这一主要机制上。但近年来一些研究发现，大多数肺心病病人仅为轻中度肺动脉高压[1，2]。单纯的肺动脉压力增高并不能完全解释慢性肺心病的发病机制。因此，推测可能还有其他因素参与肺心病的发病。有实验证明，肺心病在慢性发病过程中，伴有免疫系统紊乱，免疫细胞活性增高，免疫球蛋白含量增加[3]。提示免疫因素可能参与了肺心病的发生发展。目前研究已经证实心脏存在M2、M3受体。在肺心病大鼠模型中M2受体自身抗体的阳性率和滴度明显增高，且与大鼠左右心室病理改变高度相关。前期实验证实缺氧肺心病大鼠模型中抗M3受体自身抗体阳性率和滴度增高。这些都提示在肺心病病人出现右心衰竭的发病过程中可能也有心脏受体抗体的免疫学机制参与，尤其可能有M2、M3受体自身抗体的参与。因此，研究肺心病病人抗M2、M3受体自身抗体的产生、作用及其与右心结构的关系，为进一步探讨肺心病发病机制提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 研究对象选取2005年4月―2006年11月我院住院及门诊的肺心病病人108例，所有入选病例均采用第二次全国肺心病专业会议制定的诊断标准[4]，明确诊断为慢性阻塞性肺疾病(COPD)所致肺心病急性发作期的肺心病病人；同时选取我院门诊体检健康人30名作为对照。所有人选者均记录病史、体格检查，并进行血气分析、心脏超声学检查。所有入选者均排除自身免疫性疾病及其他心脏疾病，近1个月未用免疫抑制剂治疗。
1.2 方法
1.2.1 标本采集所有受检者均于采血前12 h禁食，于清晨07：00～08：00抽取5 mL静脉血，静置，经4℃3000 r/min离心20 min，收集上清液(血清)，放人－70℃冰箱保存待测。
1.2.2 抗原肽段的合成 M3受体抗原肽段的合成：按照人M2－胆碱能受体细胞外第二环功能表位肽段序列(169～193位氨基酸残，V－R－T－V－E－D－G－E－C－Y－I－Q－F－F－S－N－A－A－V－T－F－G－T－A－I－C)，由武汉生物化学研究所合成。M3受体抗原肽段的合成：按照人M3－胆碱能受体细胞外第二环功能表位肽段序列(18～36位氨基酸残，S－S－W－I－H－S－P－D－G－L－P－P－G－T－V－T－H)，由西安美联生物科技有限公司合成。
1.2.3 链亲和素一酶联免疫吸附实验(SA－ELISA) ①包被抗原：将合成的M2、M3受体特异性抗原多肽配成浓度为5μL/mL的抗原包被液，包被空白ELISA反应板，4℃冰箱过夜。②封闭ELISA板：用含有5％小牛血清的磷酸盐缓冲液(1％PBS溶液，0.1％Tween20和5％小牛血清，pH 7.4，PMT)封闭ELISA板，37℃水浴1 h。③稀释血清：将待测血清从1:20的浓度起倍比稀释于PMT溶液中，加样于ELISA板，37℃水浴1h。④加标记有生物素的二抗：将生物素化羊抗人IgG单克隆抗体，按1:1000的浓度稀释于PMT溶液中，加样于ELISA板，37℃水浴1 h。⑤加标记有辣根过氧化酶的链亲和素将：SA－HRP以1:1000的浓度稀释于PMT溶液中，加样于ELISA板，37℃水浴1 h。⑥加底物：将底物(ABTS)按2 nmol/L的浓度溶于pH5.O的磷酸-枸橼酸底物缓冲液中，临加样前加入H2O2(2.5 mmol/L)，37℃水浴30 min，待反应稳定后测定光密度值。⑦测定光密度值(OD)：用酶标仪于λ＝405nm处测定各孔的光密度值。以上步骤每孔加样50μL，①～⑤每步终了时用PBS－T溶液洗涤3次，每次5 min。
1.2.4 结果判定①抗体定性判定：P/N=(标本OD值－空白OD值)／(阴性OD值－空白OD值)，以P／N值≥2.1为阳性。②抗体效价判定：将血清标本从1:20起连续倍比稀释，以出现P/N值≥2.1的最高稀释度作为该标本的效价。
1.2.5 心脏超声心动图检查 SSH－140A彩色心脏超声心动图检查仪(日本，东芝)。观察指标为：右室流出道内径、右室内径。
1.2.6 血气分析AVL－995全自动血气分析仪(瑞典产)。
观察指标为：动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)。
1.3 统计学处理计量资料用均数±标准差
描述，抗体滴度以几何均数±标准差
表示，计数资料用百分数描述。两组间比较采用T检验或X2检验，多组间比较采用单因素方差分析及SNK－q检验或秩和检验。用SPSS 11.5软件处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组M2、M3受体自身抗体阳性率及抗体滴度测定结果肺心病组病人血清M2受体的自身抗体的阳性率及抗体滴度[48.15％，80(1.846±0.351)]均高于对照组[13.33％，40(1.602±0.369)]，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。肺心病组病人血清M3受体的自身抗体的阳性率及抗体滴度[40.74％，53(1.725±0.273)]均高于对照组[10.00％，20(1.301±0.000)]，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 肺心病组中M2受体自身抗体阳性组、阴性组与对照组指标的比较3组在年龄、性别、体重指数等方面无统计学意义(P＞0.05)。对照组、M2受体自身抗体阴性组、M2受体自身抗体阳性组3组比较PaO2(92.807 mmHg±4.035 mmHg、61.461mmHg±13.897 mmHg、47.539 mmHg±13.879 mmHg)呈逐渐降低趋势，PaCO2(39.377 mmHg±3。477 mmHg、50.689 mmHg±7.495mmHg、59.865mmHg±10.483mmHg)、右室流出道内径(25.067 mm±2.840 mm、32.714 mm±2.537 mm、36.615±2.499 mm)、右室内径(18.700 mm±2.879 mm、24.107 mm±2.973 mm、呈逐渐增高趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.3 肺心病组中M3受体自身抗体阳性组、阴性组与对照组指标的比较 3组在年龄、性别、体重指数等方面无统计学意义(P＞0.05)。对照组、M3受体自身抗体阴性组、M3受体自身抗体阳性组3组比较PaO2[(92.807±4.035)mmHg、(61.358±14.170)mmHg、(46.118±12.752)mmHg]呈逐渐降低趋势，PaCO2[(39.377±3.477)mmHg、(51.481±9.937)mmHg、(60.382±7.884)mmHg]、右室流出道内径[(25.067±2.840)mm、(33.688±2.693)mm、(35.909±3.421)mm]、右室内径[(18.700±2.879)mm、(24.813±2.705)mm、(26.546±2.956)mm]呈逐渐增高趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.4 肺心病病人M3受体自身抗体单阳性组、M2受体自身抗体单阳性组、M2、M3受体自身抗体双阳性组指标的比较3组在年龄、性别、体重指数、PaO2、PaCO2方面无统计学意义(P＞0.05)。在右室流出道内径[(31.857±1.345)mm、(35.000±2.000)mm、(37.800±2.178)mm]、右室内径[(23.571±2.637)mm、(25.818±1.251)mm、(27.933±1.907)mm]呈逐渐增高趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨 论
随着近年来对心脏M受体(毒蕈碱乙酰胆碱能受体)各亚型认识的逐渐加深，M受体在心脏功能调节方面作用的研究日益受到重视。M受体属于G蛋白耦联受体，通过与不同的鸟苷酸调节蛋白(G蛋白)结合，引起不同的生理生化效应。有研究显示在某些病理条件下，血清抗M受体抗体的产生与疾病的发生、发展密切相关[5]。
Magnusson等[6]与Fu等[7]相继发现在扩张性心肌病(DCM)病人血清中存在M2受体的自身抗体，提出可能与心肌病的发病有关。此后，M2受体自身抗体相继在高血压性心肌病、风湿性心肌病、缺血性心脏病等多种心脏疾病中发现，且抗体滴度明显高于正常人[8，9]。本研究结果显示，肺心病病人血清M2受体的自身抗体的阳性率及抗体滴度(48.15％，80)明显高于对照组(13.33％，40)(P＜0.05)。证实M2受体自身抗体的产生可能与肺心病的发生发展有密切关系。进一步分析肺心病病人M2受体自身抗体阳性组与阴性组的临床资料，结果显示：M2受体阳身抗体阳性组病人的动脉PaCO2较低，动脉血PaCO2较高。而右室流出道内径、右室内径及左室内径均增大，与阴性组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。表明M2受体自身抗体的产：生与肺心病心脏形态学改变密切相关。慢性肺心病病人的急性发作多并发呼吸衰竭、心力衰竭，使得机体长期或反复处于高碳酸血症和缺氧状态，可能诱发了心脏M2受体自身抗体的产生。而自身抗体反过来又通过影响受体功能而加剧心脏病理变化和功能失调[8，10]。因此在肺心病出现右心衰竭的发病过程中可能也有心脏受体抗体的免疫学机制参与。
Hellengen应用放射自显影技术首次证明心脏上还存在M3受体，此后又阐明了M3受体是通过磷脂酶C(PLC)途径发挥作用的[11]。马满玲等[12]从胆碱对大鼠和家兔心脏M3受体作用实验研究中也证实心肌上存在M3受体。研究显示在各种心脏疾病病理过程中都伴有氧化应激反应[13]。心肌在缺氧情况下可产生氧自由基，大量氧自由基可引起心肌组织的严重损伤。李丽等[14]以外源性H2O2诱导大鼠培养心肌细胞损伤模型为基础，给予M3受体激动剂胆碱和M3受体阻断剂4DAMP进行干
预，结果显示：M3受体激动对H2O2诱导的心肌细胞损伤有保护作用。Yang等[15]研究发现，激动心肌M3受体可激活Bcl－2和ERK等抗凋亡信号分子，并抑制凋亡前体蛋白Fas和p38MAPK的表达，减少细胞内Ca2＋超载，从而发挥对心肌细胞的保护作用。本研究发现，在肺心病病人的血清中存在M3受体自身抗体，其阳性率和抗体滴度(40.74％，53)均高于对照组[(10.00％，20)，P＜O.05]。提示M3受体自身抗体可能与肺心病的发病有关。进一步分析肺心病组中M3受体自身抗体阳性组与阴性组临床资料显示：M3受体自身抗体阳性组病人的PaCO2较低，PaCO2较高。而右室流出道内径、右室内径及左室内径均增大．与阴性组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步提示M3受体自身抗体可能也与肺心病心脏形态学改变有关，推测肺心病病人M3受体自身抗体表达增加，该抗体与M3受体长期结合，可以降低M3受体对乙酰胆碱的敏感性，从而抑制心肌细胞中的Bcl－2(凋亡抑制基因)蛋白表达，加速心肌细胞凋亡，进而抑制了对心肌细胞的保护作用，同时还可以造成M3受体的进行性破坏，导致受体的降解，数量减少，以上可能是导致心功能从“代偿”向“失代偿”转折的原因之一。
本研究结果显示，M2受体自身抗体与M3受体自身抗体均可能与肺心病的发生发展有关，那么两者的关系如何?故本研究又将肺心病病人分为M3受体自身抗体单阳性组、M2受体自身抗体单阳性组及M2、M3受体自身抗体双阳性组，3组进行比较显示：M2受体自身抗体单阳性组右室流出道内径、右室内径及左室内径明显高于M3受体自身抗体单阳性组，提示M2受体自身抗体在肺心病病人心脏结构变化过程中所起的作用较M3受体自身抗体明显；同时，M2、M3受体自身抗体双阳性组心脏指标较单阳性组明显增高，表明两者可能有协同作用。分析以上结果可能与心脏上M受体分布数量有关。有研究显示，M受体各亚型在心房和心室表达水平各不相同，但从总量上看，心房和心室M受体表达水平无明显差异。心脏上主要存在M2受体，M3受体只占3％[16]。
总之，M2受体自身抗体与M3受体自身抗体的产生可能参与了肺心病的发生发展，导致心脏病理变化和功能失调，且两者呈协同作用，其中M2体自身抗体起着更为主要的作用，但两者作用的具体机制及其二者的相互关系有待于进一步研究。
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作者简介：仲剑克(1970―)，男，现为山西医科大学第一临床医学院硕士研究生(邮编：030001)；刘学军、祁琨，工作于山西医科大学第一医院。