HPLC-ELSD法测定银杏叶茶中总内酯的含量

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[摘要] 目的：采用RP-HPLC法测定低酚酸银杏叶保健茶中总内酯的含量。方法：采用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇－四氢呋喃－水（25∶10∶65）为流动相，柱温为30℃，蒸发光散射检测器检测。结果：银杏叶保健茶中银杏内酯A、银杏内酯B、银叶内酯C和白果内酯的进样量的对数与峰面积的对数线性关系较好，线性范围分别为0.485～9.701 μg、0.460～9.204 μg、0.501～11.899 μg、0.935～18.703 μg；银杏内酯A、银杏内酯B、银叶内酯C和白果内酯加样回收率分别为100.45%（RSD为2.79%）、98.29%（RSD为2.90%）、98.22%（RSD为2.53%）、101.32%（RSD为1.81%）。结论：本方法简便、准确、分离效果好，适合于银杏叶茶总内酯的含量测定。

[关键词] 银杏叶茶；总内酯；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）02（b）-040-03

Determination of Ginkgolides in teas of Ginkgo biloba by hplc-elsd

SONG Weifeng1, LI Ruiming2

(1.The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangdong Province, Guangzhou 510630, China; 2.The First Affiliated Hospital of Sun-Sen University, Guangdong Province, Guangzhou 510080, China)

[Abstract] Objective: To establish an RP-HPLC method for quantitative determination of Ginkgolides in teas of Ginkgo biloba. Methods: The evaporation light scattering detector(ELSD) were employed. The analytical column was C18 column (4.6 mm× 250 mm, 5 μm). The mobile phase was composed of methanol-tetrahydrofuran-water(25∶10∶65) at a flow rate of 1.0 ml/min. Results: The logarithm value of sample size had a good linear relationship with the logarithm value of peak area when the sample size of ginkgolide A,B,C and bilobalide was 0.485～9.701 μg, 0.460～9.204 μg, 0.501～11.899 μg, 0.935～18.703 μg respectively. The average recovery was 100.45%(RSD=2.79%), 98.29%(RSD=2.90%), 98.22%(RSD=2.53%), 101.32% (RSD=1.81%) respectively. Conclusion: This method is sensitive, repeatable and suitable to determine the content of total Ginkgolides in teas of Ginkgo biloba.

[Key words] Teas of Ginkgo biloba; Ginkgolides; Determination

银杏叶保健茶是由市售银杏叶经过净选、洗净、烘干、粉碎及超临界二氧化碳萃取、分装等工序制备出的袋泡茶剂[1]。脱酸银杏叶茶中主要含有黄酮类化合物和银杏萜类内酯两类生物活性物[2]。其中萜类内酯成分主要以银杏内酯A（C20H24O9）、银杏内酯B、（C20H24O10）、银杏内酯C（C20H24O11）和白果内酯（C15H18O8）为主。经各国学者对其药理作用进行多年研究发现银杏内酯为特异性血小板活化子（PAF）的强拮抗药。PAF是一种内源性磷脂，由血小板和多种炎症细胞产生、分泌，与许多疾病的发生、发展密切相关。而银杏内酯为目前天然PAF受体拮抗药中最具用前景的药物[3]。另外，已有研究证实，银杏苦内酯还能影响脑的调节功能，可改善与年龄相关的记忆力减退[4]。目前银杏叶每年消耗量已经达10多万吨[5]，具有很高的药用与食用价值[6]。本文用HPLC方法测定总内酯的含量，为建立银杏叶茶质量控制方法提供依据。

1 仪器与试剂

WATERS 2695/2996（ailliance）、色谱柱Agilent C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、SEDX75型蒸发光散射检测器、KQ-300超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

银杏内酯A对照品（供含量测定用，批号10862-200807），银杏内酯B对照品（供含量测定用，批号110863-200806），银杏内酯C对照品（供含量测定用，批号110864-200805），白果内酯对照品（供含量测定用，批号110865-200804），以上对照品均由中国药品生物制品检验所提供。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯，银杏叶茶（批号201001、201002、201003，自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以甲醇－四氢呋喃－水（25∶10∶65）为流动相，柱温为30℃，蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3 000。在本条件下，银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C及白果内酯能达到较好分离，样品其他成分对测定无干扰，结果见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压真空干燥24 h的银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品和白果内酯对照品适量，加50%甲醇制成每1 ml含0.18 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.20 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备[7]取本品中粉约1.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（30～60℃）在70℃水浴上回流提取1 h，弃去石油醚（30～60℃）液，药渣和滤纸筒置于60℃烘箱中挥干溶剂，再加甲醇回流提取6 h，提取液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 ml量瓶中，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，取出放冷，加甲醇至刻度，摇匀，静置，精密量取上清液5 ml，置于酸性氧化铝柱上（200～300目，3 g，内径1 cm，用甲醇湿法装柱），用甲醇25 ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣用甲醇5 ml分次转移至10 ml量瓶中，加水约4.5 ml，超声处理（功率300 W，频率500 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得

分别精密吸收照品溶液10、20 μl，供试品溶液10～20 μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银叶内酯C和白果内酯的含量，即得。总萜内酯含量＝银杏内酯A含量＋银杏内酯B含量＋银叶内酯C含量＋白果内酯含量。

2.2.3 线性关系的考察精密称取五氧化二磷干燥过夜的银杏内酯A 10 mg、银杏内酯B 10 mg、银杏内酯C 10 mg、白果内酯20 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作为储备液。分别精密移取0.10、0.50、1.00、1.50 ml置于2 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，再加上原储备液，共5个样品作为供试品溶液。分别精密吸取5 μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，并以浓度对数值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标，进行线性回归，结果银杏内酯A 回归方程为：Y=1.385 3X+13.889 0，r=0.999 8；银杏内酯B回归方程为：Y=1.231 0X+12.446 0，r=0.999 5；银杏内酯C回归方程为：Y=1.478 0X+14.559 0，r=0.999 9；白果内酯回归方程为：Y=1.368 0X+14.210 0，r=0.999 7。线性实验结果表明，银杏内酯A（0.485～9.701 μg）、银杏内酯B（0.460～9.204 μg）、银杏内酯C（0.501～11.89 9 μg）和白果内酯（0.935～18.703 μg）其峰面积对数值与进样量对数值呈现良好的线性相关性。

2.2.4 精密度试验精密吸取混合对照品溶液10 μl，重复进样5次，记录峰面积。结果银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量的RSD的分别为0.54%、0.68%、0.25%、1.38%。

2.2.5 稳定性试验取银杏叶茶（批号201001）的供试品溶液，分别于（0、1、2、4、8、12、24 h）进样10 μl记录峰面积，结果银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量的RSD分别为0.66%、0.88%、0.38%、0.51%。

2.2.6 重现性试验取同一批号银杏叶茶（批号批号201001）各6份，按2.2.2项中方法制备供试品溶液，分别进样10 μl记录峰面积，计算含量，再按“总萜内酯含量＝银杏内酯A含量＋银杏内酯B含量＋银叶内酯C含量＋白果内酯含量”进行计算，样品中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量为0.092%、0.074%、0.047%、0.143%。总萜内酯含量平均含量为0.357%（RSD=1.52%）。

2.2.7 加样回收率试验精密称取已知含量的同一批号银杏叶茶（批号201001）适量，按下表精密加入对照品，按供试品溶液制备项下操作测定，结果见表1。

2.2.8 样品含量测定分别取3批银杏叶茶样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液10 μl及供试品溶液10 μl，注入色谱仪，记录峰面积。按外标法计算样品中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量，并计算总萜内酯含量，结果见表2。

3 讨论

在样品制备过程中，采用索氏提取器石油醚回流提取。这是一种提取比较完全的方法，目的是脱去叶中的叶绿素等脂溶性成分，以减少对后面样品处理的干扰。关键参数是药材的粉碎程度，回流的溶剂及回流的时间。由于银杏叶茶是经粉碎，颗粒小于20目，并经超临界二氧化碳萃取初步脱脂过[8]、粉末疏松，比较细，因此不需再经粉碎可直接加石油醚索氏提取，只需用石油醚充分回流和浸泡就可以脱去大部分的脂溶性成分。

过酸性氧化铝柱的目的是吸附样品中的黄酮类成分，由于蒸发光检测器是通用型检测，大量的黄酮杂质会对色谱图及含量测定带来比较大的影响。而酸性氧化铝的吸附性能与含水情况有很大的关系，因此上柱前要保证氧化铝粉末是未受潮的，用具等都要经过烘干，避免有水，从而可避免其对含量测定结果的影响。

[参考文献]

[1]廖美金,李瑞明.低酚酸银杏叶茶的制备[J].中国医药导报,2011,8(2):63.

[2]李冶,郑伟文.银杏叶提取物的药理研究与临床应用[J].现代食品与药品杂志,2007,2(31):1452-1454.

[3]卢鑫,高尔.银杏苦内酯药理作用的研究进展[J].中国药房,2006,l7(3):221-223.

[4]林悦,武宇明.银杏内酯中枢作用的研究进展[J].中国现代中药,2009, 11(2):11-13,26.

[5]蔡德山.银杏叶药物市场分析[J].中国医药技术经济与管理,2009,3(2):7-13.

[6]蒲丽丽.银杏的药用食用价值及在食品工业中的应用[J].农村经济与科技,2010,21(4):110,53.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2010:296.

[8]曹明霞,徐溢,赵天明,等.超临界萃取在天然植物成分提取中的应用进展[J].广州化工,2010,38(8):23-25,37.

（收稿日期：2010-12-15）