参芪复方对GK大鼠胰岛β细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

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摘要 目的：观察参芪复方对自发性2型糖尿病动物gk大鼠（Goto-Kakizaki wister rats）胰岛β细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法：选取4月龄SPF级雄性GK大鼠50只，随机分为模型组，盐酸二甲双胍组，参芪复方低、高剂量组，并另设正常Wister大鼠对照组。连续灌药4周后，TUNEL染色观察各组胰岛β细胞凋亡指数（AI），并采用免疫组化染色，Mias-2000图像分析系统观察各组大鼠胰岛β细胞caspase-3阳性物质积分光密度。结果：模型及低剂量组β细胞AI较正常组显著增高（P

关键词 参芪复方 GK大鼠 胰岛β细胞凋亡 Caspase-3

参芪复方主要由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成，具有益气养阴、清热生津、活血化瘀的功效，在临床使用取得了较好的疗效。以往研究提示，参芪复方具有抗2型糖尿病早期动脉粥样硬化、低度炎症的作用[1-2]，但其对胰岛β细胞凋亡的影响未见报道。本研究观察了其对自发性2型糖尿病动物GK大鼠胰岛β细胞凋亡的影响并对其可能作用机制进行了初步探讨。

1 材料

1．1 动物：4月龄雄性SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠10只（中国科学院上海实验动物中心提供），按2~3只/笼饲养于独立通气笼具（IVC）系统内。

1．2 主要药品与试剂：参芪复方浸膏粉（1g浸膏粉相当于原生药10g，四川大学华西药学院药厂提供，批号20031008），盐酸二甲双胍片（天津太平洋制药有限公司，批号：20040523），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（博士德公司），Caspase-3一抗、即用型SABC试剂盒（博士德公司）。

1．3 主要仪器：Mias-2000图象分析系统（四川大学智胜软件股份有限公司），OLYMPUS BX50型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）等。

2 方法

2．1 分组方法：GK大鼠适应性饲养1周后，尾静脉取血测随机血糖，随机血糖≤11．1mmol/L者剔除，共有6只[3]。余44只按血糖由高到低排列编号，依据随机排列表分为模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药高剂量组，另设普通Wister大鼠正常对照组，每组11只。各组均喂饲普通饲料。

2．2 给药方法：正常对照组和模型组予生理盐水5ml/kg・d灌服；二甲双胍组予盐酸二甲双胍125．0mg/kg・d，中药低剂量、高剂量两组分别予参芪复方0．5g/kg・d、2．0g/kg・d，共28天。

2．3 观察指标及检测方法：有两项。

2．3．1 β细胞凋亡计数：大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，应用TUNEL法染凋亡细胞，试剂盒购于博士德公司，操作按试剂盒说明进行。光镜下观察凋亡细胞核呈紫蓝色，胞浆呈棕黄色颗粒。每例切片计数10个400倍视野的凋亡细胞数，然后按公式计算细胞凋亡指数（AI）。AI＝凋亡细胞数/总细胞数×100％。

2．3．2 胰岛Caspase-3表达：大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，用FFA液（甲醛醋酸酒精固定液）固定，石蜡包埋，滚动式切片机纵切成4μm薄片，将切片置于经防脱片剂处理后的载玻片上，使切片紧密粘附，常规脱蜡至水，余参照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书染色。用OLYMPUS BX50光学显微镜观察染色结果，胞浆棕染为阳性，每张切片选3个胰岛，输入Mias-2000图像分析系统，在200倍镜下分别测量胰岛细胞Caspase-3阳性物质积分光密度并计算其均值。

2．4 统计方法：用SPSS13．0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析。方差齐采用LSD，方差不齐采用Tamhanecs’T2统计方法。

3 结果

3．1 一般状况：实验过程中模型组3只大鼠、低剂量组和二甲双胍组各1只大鼠死亡。其余各组大鼠无死亡。

3．2 参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数的影响：具体见表1。模型组及低剂量组较正常组凋亡指数显著增高（P0．05)；各治疗组凋亡指数较模型组显著降低（P

3．3 参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞Caspase-3表达影响：具体见表2。模型组与低剂量组Caspase-3积分光密度较正常组显著增高（P0．05）；高剂量组及二甲双胍组Caspase-3积分光密度较模型组显著下降（P0．05）；高剂量组和二甲双胍组积分光密度较低剂量组显著降低（P

4 讨论

GK大鼠是由Goto等1975年通过对Wistar大鼠进行口服葡萄糖耐量试验并筛选高血糖的个体进行培育而来的自发性非肥胖性2型糖尿病动物模型。具有胰岛素分泌不足、葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，β细胞数目减少，肝糖生成过多，肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗等典型2型糖尿病特征，并且在长期糖尿病之后，易患有各种并发症[4]。为研究2型糖尿病的一种较为理想的动物模型。

细胞凋亡(apoptosis)，是由局部环境生理或病理性变化引起的、自身内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细胞自发性死亡方式。染色质浓集、胞膜皱缩和凋亡小体的形成为其形态学特点，核酸内切酶活化，使染色质在核小体间断裂，从而在DNA电泳时形成特征性的梯形带为其生化特征。它常涉及一系列的基因激活表达及调控，是生物界重要的生命现象之一。

过去认为胰岛素抵抗在2型糖尿病病理生理机制中占主要位置，但Butler等[5]研究表明，无论是肥胖还是非肥胖的2型糖尿病患者，与其体重指数相当的非糖尿病人群相比，其胰岛β细胞数目明显减少，胰岛β细胞凋亡发生率也明显高于正常人群，而两组人群间胰岛再生和分化过程并无明显区别。这个结果高度提示胰岛β细胞凋亡数目减少在2型糖尿病患者胰岛功能衰竭中发挥了举足轻重的作用。因此，延缓和（或）防止胰岛β细胞凋亡已成为糖尿病治疗的一个重要方向。本研究证实参芪复方能显著抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，提示降糖作用不及西药的中药复方可能通过干预胰岛β细胞凋亡这一重要环节治疗2型糖尿病。

目前研究认为，半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族是细胞凋亡过程的中心成分。外界信号分子通过线粒体途径或死亡受体途经激活Caspasae家族导致凋亡的发生，两条途经的关键环节是Caspase-3的活化[6]。活化的Caspase-3通过进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞发生凋亡。因此，Caspase-3是反映凋亡的一个很好指标[7]，处于凋亡发生的关键环节，检测Caspase-3可较其它方法更能检测凋亡的早期事件[8]。本研究证实，参芪复方可显著减少GK大鼠胰岛β细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达，以高剂量组作用明显。因此，我们认为减少胰岛β细胞Caspase-3表达可能为参芪复方抗胰岛β细胞凋亡的机制之一。

总之，本研究初步证实参芪复方可明显改善GK大鼠胰岛β细胞凋亡，保护胰岛β细胞，其机制可能与抑制胰岛β细胞Caspase-3表达有关。

5 参考文献

［1］张红敏,陈世伟,谢春光，等.参芪复方抗自发性糖尿病GK大鼠早期动脉粥样硬化的作用机制［J］.中国中药杂志2006，31(15):1272-1275.

［2］张红敏,陈世伟,谢春光,等.参芪复方对大鼠炎症标志物的影响及机理探讨［J］.中药材，2006，29(3):249-252.

［3］黄松.糖尿病动物模型研究现状及进展［J］.广西医学，2002，24(1):46-48.

［4］Picarel-Blanchot F, Berthelier C, Builbe D, et al. Imparied insulin secretion and excessive hepativ glucose production are both early events in the diabetic GK rat［J］. Am J Physio1, 1996, 271(4pt1):E755.

［5］Butler AB，Janson J, Bonner Weir S et al. Beta-cell deficit and in-creased beta cell apoptosis in humans with type 2 diabetes［J］ .Diabetes, 2003, 52(1):102-110.

［6］Green DR. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors［J］. Cell，2000,102(1):1-4.

［7］张勇,沈佰华,马安伦.用荧光定量法检测Caspase-3的活性［J］.细胞与分子免疫学杂志，2001，17(2):188-190.

［8］彭黎明,江虹.细胞凋亡检测方法的研究进展［J］.中华病理学杂志，2001，20(2):135-136.

收稿日期 2007-06-07

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”

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