地瓜参总皂苷含量测定方法研究

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摘要 以人参皂苷Re为标准对照，香草醛—冰醋酸—高氯酸作为显色体系，建立地瓜参皂苷含量测定方法，结果表明：皂苷浓度在40～200 μg/mL时，与吸光度值呈良好线性关系，加标回收率为101.9%，RSD=4.63%，精密度试验RSD=1.77%，稳定性试验RSD=3.16%，重复性试验RSD=3.15%，说明方法学各指标均符合要求。

关键词 海参；总皂苷；测定方法

中图分类号 O657.32 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）20-0084-02

海参皂苷，也称海参皂甙，是由苷元和糖链通过β-糖苷键结合而成，苷元常为四环三萜和五环三萜。在化学结构上，大多属于羊毛甾醇型三萜类寡糖苷。组成寡糖苷的单糖主要有木糖、葡萄糖、喹喏糖、3-甲基木糖、3-甲基葡萄糖等[1]。具备提高免疫力[2]、抗肿瘤[3]、抗真菌[4]的功能，并且还具有抑制排卵和刺激子宫收缩[5]、溶血[6]、抗病毒[7]、降血脂[8]等多种生物活性，因而备受关注。但由于缺乏统一的标准品，而且不同科海参的皂苷结构差别很大[9]，长期以来海参皂苷的定量测定存在较大困难，至今仍没有合适的测定方法。该文以地瓜参中皂苷作为研究对象，建立了一种较为简便适用的方法，为地瓜参总皂苷进一步深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：地瓜参，采自舟山市沿海海域，洗净绞碎；人参皂苷Re标准品（中国药品生物制品检定所）；D101型号大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工厂）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

721PC型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱、DKB-501A型超级电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 地瓜参总皂苷供试液的制备。新鲜地瓜参去除内脏，体壁经洗净沥水后用绞肉机绞碎3～4次，碎肉用70%乙醇在70 ℃条件下按料液比1∶2.0热浸提3次，每次3 h，收集浸提液旋转蒸发除去乙醇，然后分散于水中，过滤，滤液上样于已处理过的D101大孔吸附树脂柱进行分离，再用石油醚、三氯甲烷、饱和正丁醇各萃取3次，收集正丁醇萃取液经旋转蒸发浓缩，冻干得到地瓜参总皂苷，取约20.0 mg用甲醇超声溶解定容至100 mL。

1.3.2 地瓜参总皂苷性质鉴定[10]。①泡沫试验：取地瓜参总皂苷样液2 mL，激烈振荡1 min后，观察泡沫产生情况。②沉淀反应：取地瓜参总皂苷样液2 mL，加入少许BaCl2，充分摇匀溶解后，观察有无白色沉淀。③Molish反应：取地瓜参总皂苷样液2 mL，加入2～3滴10% α-萘酚乙醇试剂，充分摇匀后，沿试管壁加入1 mL浓硫酸，观察两液层交界面处紫色环的出现情况。④Libermann-Burchard反应：取地瓜参总皂苷冻干品10 mg，加冰醋酸0.5 mL使溶解，续加醋酐0.5 mL搅匀，再于试管的边沿滴加2滴浓硫酸，观察并记录现象。

1.3.3 皂苷测定波长的确定。采用《中国药典》2010年版中“附录VA紫外-可见分光光度法”[11]进行光谱扫描。人参皂苷Re标准品溶液和供试样品溶液按2.3.3.4处理后在400～800 nm范围内作波长扫描。以不加标准品溶液的平行样作为空白，确定最大吸收波长。

1.3.4 皂苷测定方法。精确称取人参皂苷Re标准品20.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL。吸取人参皂苷Re标准溶液（0.2 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL（相当于人参皂苷Re 0、40、80、120、160、200 μg）于10 mL比色管中，水浴蒸干溶剂，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加热15 min，立即以冰水冷却5 min，加入5 mL冰醋酸，摇匀，静置10 min后，537 nm测定吸光度，绘制标准曲线。取地瓜参皂苷样液，进行同上处理，计算皂苷含量：

式中：X—样品中总皂苷含量（g/100 g）；m—试样质量（g）；V1—样品提取液总体积（mL）；V2—样品提取液测定用体积（mL）；m1—从标准曲线查得待测液中皂苷含量（g）。

1.3.5 精密度试验。精密吸取人参皂苷Re对照品溶液适量于具塞试管中，分别测定6组平行，进行皂苷含量测定。

1.3.6 稳定性试验。精密吸取样品于具塞试管中，分别放置5、10、15、30、45、60、90、120、150 min后测定皂苷含量。

1.3.7 重复性试验。取同一批样品（冷冻干燥制成的干品）6份，每份5.00 g，照样品溶液制备方法制备，精确吸取各样品溶液适量，进行皂苷含量测定。

1.3.8 加标回收率试验。取同一批样品（冷冻干燥制成的干品）6份，每份5.00 g，精密称定，按照样品溶液制备方法制备，然后吸取各样品溶液适量于试管中，精确加入一定量的人参皂苷Re对照品，进行皂苷含量测定。

2 结果与分析

2.1 地瓜参总皂苷性质鉴定

地瓜参总皂苷的性质鉴定结果如表1所示，水溶液经激烈振荡产生许多泡沫，说明可能含有皂苷或者蛋白等物质，泡沫保持10 min以上不消失，经加热亦不消失，说明样品为皂苷类物质；水溶液经加入BaCl2能够产生白色浑浊，说明可能有皂苷的存在；Molish反应显色阳性特征，说明含有糖类或物质包含糖链；Libermann-Burchard反应的颜色反应显示，地瓜参总皂苷主要物质为甾体皂苷。

2.2 地瓜参皂苷测定方法

2.2.1 测定波长的确定。香草醛—高氯酸能与人参皂苷Re对照品及地瓜参皂苷发生紫红色的颜色反应，进行紫外可见光谱扫描，标准品在537 nm处有最大吸收峰，而供试样品在（537±2）nm有最大吸收峰，故确定537 nm为检测波长。

2.2.2 标准曲线。结果如图1所示，得到的线性回归方程为y=0.003 8x+0.007 1，相关系数R2=0.999 6，表明浓度在40～200 μg/mL时与吸光度值呈良好线性关系。

2.2.3 精密度试验。结果如表2所示，平均吸光度值为0.115，RSD为1.77%。表明精密度较好。

2.2.4 稳定性试验。结果如表3所示，平均吸光度值为0.102，RSD为3.16%。结果表明显色反应在5～150 min内稳定。

2.2.5 重复性试验。测定结果如表4所示，平均吸光度值为0.135，RSD为3.15%。结果表明该方法重复性较好。

2.2.6 加标回收率试验。测定结果如表5所示，平均加样回收率为101.9%，RSD为4.63%。结果表明该方法能够准确地测定地瓜参总皂苷的含量。

3 结论与讨论

研究显示，以香草醛—冰醋酸—高氯酸为显色体系，人参皂苷Re为标准对照，在波长为537 nm下，检测体系呈现良好地线性关系，线性回归方程为y=0.003 8x+0.007 1，相关系数R2=0.999 6，表明浓度在40～200 μg/mL时与吸光度值呈良好线性关系，加标回收率为101.9%，RSD=4.63%，精密度试验RSD=1.77%，稳定性试验RSD=3.16%，重复性试验RSD=3.15%，说明方法学各指标均符合要求。

4 参考文献

[1] 邹峥嵘，易杨华，张淑瑜，等.海参皂苷研究进展[J].中国海洋药物，2004（1）：46-53.

[2] 王静凤，傅佳，王玉明，等.革皮氏海参皂苷对小鼠免疫功能的调节作用[J].中国海洋大学学报，2010，40（2）：28-32.

[3] 樊廷俊，袁文鹏，丛日山，等.仿刺参水溶性海参皂苷的分离纯化及其抑瘤活性研究[J].药学学报，2009，44（1）：25-31.

[4] 丛日山，袁文鹏，樊廷俊，等.仿刺参水溶性海参皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究[J].中国海洋大学学报，2006，36（6）：959-964.

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[10] 沈向红，任一平，陈翊.HPLC法与香草醛比色法测定保健品中的人参皂甙[J].中国卫生检验杂志，2004，14（6）：681-683.

[11] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部附录[S].北京：中国医药科技出版社，2010.