高效凝胶色谱串联蒸发光散射检测器测定热毒宁注射液中聚山梨酯80的含量
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[摘要] 目的：采用高效凝胶色谱-蒸发光散射法（HGPC-ELSD），建立热毒宁注射液中聚山梨酯80的含量测定方法，控制热毒宁注射液中聚山梨酯80的质量。方法：采用TOSH TSK-GEL G4000PWxl（7.8 mm×300 mm，10 μm）色谱柱，以水为流动相，流速0.7 mL・min-1，柱温30 ℃；蒸发光检测器，漂移管温度55 ℃，载气为氮气，流量2.0 L・min-1，增益1.0。结果：聚山梨酯80质量浓度在1.01～15.20 g・L-1线性关系良好（ R2+=0.999 3） ； 方法回收率为98.10%（RSD 2.0%） 。结论：该方法简单、快速，重复性好，适用于热毒宁注射液中聚山梨酯 80 的测定。
[关键词] 热毒宁注射液；聚山梨酯80；高效凝胶色谱-蒸发光散射法；质量控制
[收稿日期] 2014-03-06
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）
[通信作者] 萧伟，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新制剂的研究与开发，E-mail：
[作者简介] 沈娟，工程师，主要从事中药材规范化种植与质量标准研究，Tel：（0518）81152322，E-mail：
聚山梨酯80收载于美国药典、欧洲药典和《中国药典》[1]，又名吐温-80，化学名为聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯，是一种稳定的非离子型表面活性剂[2]，可用作乳化剂、分散剂、增溶剂或稳定剂等，被广泛应用于药物和食品。很多中药注射剂在制备工艺过程中因挥发性成分增溶的需要加入了聚山梨酯 80。近年来研究发现，聚山梨酯 80的浓度在0.5%以内安全性较好[3]，故中药注射剂中聚山梨酯 80的检测与控制对于保证临床用药安全具有重要意义[4-5]。热毒宁注射液处方由栀子、金银花、青蒿3 味药材组成，具有清热、疏风、解毒等功效。制剂中因青蒿药材挥发性成分的有效利用，使用了聚山梨酯 80作为增溶剂，故增加了制剂中聚山梨酯 80的检测。关于聚山梨酯 80的含量测定已有一定的文献报道[6-9]，采用硫氰酸钴铵显色法测定聚山梨酯 80时会出现显色干扰，影响检测结果。本文建立了高效凝胶色谱串联蒸发光散射法测定热毒宁注射液中聚山梨酯 80的含量测定方法，该方法方便、快捷，可用于热毒宁注射液中聚山梨酯80的含量测定。
1 材料
Agilent-1200液相色谱仪及工作站，Alltech 3300 ELSD，METTLER AE240电子天平；氯仿（分析纯，南京化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，聚山梨酯 80（注射级，南京威尔化工有限公司）。热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司，批号100906，101011，110702，110703，110704，110705，110708，110710，110711，110714）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 TSK G4000 PWxl 凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；以水为流动相；流速0.7 mL・min-1；柱温30 ℃；ELSD 检测条件： 漂移管温度55 ℃ ， 氮气流速2.0 L・min-1，增益 1.0；进样体积20 μL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取聚山梨酯 80适量，加水溶解并稀释成每1 mL含50 mg的对照品贮备液。量取上述贮备液适量，用水稀释成每1 mL含5.068 2 mg的聚山梨酯 80对照品溶液，摇匀，备用。
2.3 供试品溶液的制备 精密吸取供试品5 mL置分液漏斗中，加入氯仿萃取5次，每次10 mL，小心分取氯仿层（不能混有水层），合并氯仿液，挥干，残渣加水溶解，转移至5 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
2.4 阴性样品溶液的制备 取不加聚山梨酯 80工艺制得样品同供试品制备法制得溶液。
2.5 阳性样品溶液的制备 精密称取聚山梨酯 80约10 mg，加入5 mL水溶解，转移至置分液漏斗中，按2.3项下自“加入氯仿萃取5次”起，同法制备溶液，作为阳性样品溶液。
2.6 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。供试品溶液分离度好，达到定量要求，阴性样品的色谱图在聚山梨酯 80保留时间的相应位置上无峰出现，表明此方法专属性强，阴性无干扰。
2.7 线性关系考察 精密量取上述贮备液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL至10 mL量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，进样10 μL。测定峰面积，以浓度 对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标，绘制标准曲线。对数方程Y=1.737 9X+2.012 8，R2+=0.999 3。表明本法在1.013 64～15.204 6 g・L-1具有良好的对数线性。
2.8 精密度试验 精密吸取110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作，进样20 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果聚山梨酯80峰面积的RSD 1.9%，表明仪器精密度良好。
2.9 样品稳定性试验 精密吸取110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作，在0，2，4，8，12，24 h进样20 μL，测定峰面积。结果样品面积的RSD 0.99%，表明本法在24 h内有良好的稳定性。
2.10 重复性试验 精密吸取6份110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作。进样，每次20 μL，测定峰面积并计算含量和RSD。结果热毒宁注射液中聚山梨酯80的平均质量分数为1.89 g・L-1，RSD 2.1%。表明本法具有良好的重复性。
2.11 加样回收率试验 采用加样回收法。精密吸取已知含量的110703批次热毒宁注射液样品6份各2.5 mL，精密加入聚山梨酯 80对照品适量加水至5 mL，按供试品溶液的制备项下操作，吸取20 μL进样。测定峰面积并计算回收率，见表1，聚山梨酯80的平均回收率为99.37%，RSD 0.67%。表明本法回收率符合含量测定要求。
2.12 样品测定 通过对聚山梨酯 80的线性、精密度、稳定性、重复性和回收率等进行考察，证明该方法可以用于测定聚山梨酯 80含量。按上述方法，测定10批热毒宁注射液成品中聚山梨酯 80含量，见表2。
3 讨论
3.1 测定方法的选择 TSK-GEL Wxl 的填充色谱柱是一种高水相的凝胶色谱柱，用于分析和制备水溶性的物质，例如蛋白质、酶、核酸。蒸发光散射检测器可以检测不挥发的成分，其响应值与光学性能和官能团无关。聚山梨酯80是一种大分子物质，不具有紫外末端吸收和不挥发的特性，因此选择用高效凝胶色谱串联蒸发光散射检测法检测热毒宁注射液中的聚山梨酯80。
3.2 流动相组成和比例的选择 试验过程中比较了乙腈-20 mmol・L-1醋酸铵（10∶90）、乙腈-20 mmol・L-1醋酸铵（5∶95）、20 mmol・L-1醋酸铵水溶液、水溶液，结果表明以水溶液为流动相时色谱峰分离度高，峰形较好。
3.3 色谱柱比较 本实验比较了Phenomenx poly Sep-GFC-P1000，Phenomenx Bio Sep-SEC-S2000，Waters UltrahgdrogelTM 120，TOSH TSK-GEL G1000PW，TOSH TSK-G2000SWxl和TOSH TSK-GEL G4000PWxl色谱柱，结果TOSH TSK-GEL G4000PWxl（可检样品相对分子质量2 000～300 000）色谱柱对聚山梨酯80的分离效果更佳。
中药注射液成分复杂， 部分品种不适合直接上凝胶柱进行分析， 样品的前处理方法十分重要， 需视具体情况进行， 热毒宁注射液根据干扰成分的性质采用液-液萃取方法去除干扰，保证了该测定方法的准确性；该方法的建立也间接的控制了热毒宁注射液的安全性和有效性。
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Determination of polysorbate 80 in Reduning injection by HGPC-ELSD
SHEN Juan， ZHANG Qiao， LI Jia-chun， BI Yu-an， WANG Zhen-zhong， XIAO Wei
（1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] Objective： To establish the method for determining polysorbate 80 in Reduning injection by HPLC-ELSD， and to control the mass of polysorbate 80 in Reduning injection. Method： It was performed by HGPC-ELSD with TOSHTSK-GEL G4000PWxl （7.8 mm×300 mm，10 μm）. Water was used as mobile phase， the flow rate was 0.7 mL・min-1， and the temperature was set at 30 ℃. The evaporated light scattering detector was adopted. The drift tube temperature was 55 ℃， and nitrogen was used as carrier gas， with the flow rate of 2.0 L・min-1 and gain of 1.0. Result：The calibration curve showed good linearity of polysorbate 80 in the test range from 1.01 to 15.20 g・L-1（r2+=0.999 3）. The recovery rate was 98.10% with RSD of 2.0%.Conclusion： The method is simple， rapid， accurate and reliable and suitable for the determination of polysorbate 80 in Reduning injection.
[Key words] Reduning injection； polysorbate 80； HGPC-ELSD； quality control
doi：10.4268/cjcmm20141523